豆根管食通口服液对人食管癌细胞端粒酶活性影响的实

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1、豆根管食通口服液对人食管癌细胞端粒酶活性影响的实【摘要】　　目的观察豆根管食通口服液体外对Eca-109细胞毒性及端粒酶活性的影响，从细胞分子水平探讨该药的作用机制。方法实验选择人Eca-109细胞株，采用MTT分析法，测定不同浓度豆根管食通口服液单用及与5-氟脲嘧啶(5－Fu)合用对Eca-109细胞的直接细胞毒作用；采用端粒重复序列扩增法(TRAP)、酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测端粒酶的活性变化。结果①豆根管食通口服液对Eca-109细胞的细胞毒作用：MTT结果显示对Eca-109细胞的生长有明显的抑制作用，各实验组与正常对照组OD值的差异有统计学意义，且在一定的浓度范围内存在剂量

2、依赖性。②豆根管食通口服液对Eca-109细胞端粒酶活性的影响采用TRAP-PCR-ELISA法检测端粒酶活性，1倍及2倍的IC50豆根管食通口服液与对照组相比存在非常显著性差别；24～72h各实验组和端粒酶阳性对照组相比均有非常显著性差异（P﹤0.01）；3个剂量中药培养食管癌Eca-109细胞至相同时间段，其端粒酶活性表达显示出一定的量效关系，在0.5倍至2倍IC50之间，呈现出正相关。结论①豆根管食通口服液在体外具有明显抑制Eca-109细胞的作用，与药物浓度呈正相关；②在一定的浓度范围内豆根管食通口服液可下调Eca-109细胞的端粒酶活性；③抑制端粒酶活性可能是豆根管食通口服液的抗癌机

3、制之一。【关键词】豆根管食通口服液；Eca-109细胞；食管癌；端粒酶　　食管癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一。中国是世界上食管癌的高发国家，也是目前世界上食管癌死亡率最高的国家，平均年死亡率为17.38/10万，居恶性肿瘤死亡的第四位，在河南省更是位居恶性肿瘤之首［1］，目前治疗仍以手术、放化疗为主要手段，其临床治疗效果不甚满意，5年生存率不到15%［2］，而中医药在肿瘤的综合治疗中具有独特的优势。现代研究认为，食管癌的形成既非单纯环境所致，也非仅仅遗传素质所为，而是发生在食管上皮单纯增生、不典型增生、原位癌、浸润癌整个自然病史中的多因素、多阶段、多基因变异累积及其相互作用的复杂过程。以分子生

4、物学的观点认识疾病，可以说，疾病都是以症状为表型，直接或间接地与基因相关的基因病。食管癌的发生和演进除了涉及多个癌基因、抑癌基因的异常外，还存在另一非常重要的生物学特性，即以细胞的永生化来维持它的无限生长。端粒与端粒酶在近年已受到国际生物学界高度重视，是肿瘤研究的热点之一，它们与细胞衰老、分裂、永生化和癌变有密切关系。端粒酶的激活与食管癌的发生发展密切相关，并可能为食管癌的治疗提供新途径。我们采用端粒重复序列扩增法(TRAP)，酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测了豆根管食通口服液对人食管癌Eca-109细胞端粒酶活性的影响。　　目前，端粒及端粒酶已被广泛认为可作为肿瘤的标记物以及抗肿瘤治疗的

5、靶点，对于端粒和端粒酶的进一步深入研究，不仅有助于人们更好地理解肿瘤发生的可能机制，而且可为人们通过检测端粒酶的活性来预测细胞的恶变倾向，以及抑制端粒酶的活性而进行肿瘤治疗提供了一个良好的途径。　　1材料与仪器　　1.1试剂RPMI-1640培养粉，美国GIBCO公司产品；胎牛血清(FBS，200ml/瓶)，天津TPD血液研究所产品；四甲基偶氮哇盐［3-(4,5-dimethylthiazol)-2,5-diphenylte-2H-tetrazoliumbromide,MTT］，瑞士Fluka产品；二甲基亚砜（DimethylSulfoxide，DMSO），天津市登峰化学试剂厂产品；5-氟尿嘧

6、啶注射液(5-Fu)：上海旭东海普药业有限公司产品（250mg/10ml），批号：031002，实验前配成所需浓度；多聚赖氨酸(Poly-L-Lysine)，北京中山生物技术有限公司产品。聚乙二醇辛基苯基醚(Triton-100)，美国Sigma产品；浓缩型3,3'一二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)试剂盒，北京中山生物技术有限公司产品；端粒酶PCR-ELISA检测试剂盒(TeloTAGGGTelomerasePCRELISAILUS)，德国Roche公司产品。　　1.2仪器烘箱、96孔培养板、24孔培养板，美国Costar公司产品；微量移液器，芬兰Biohit公司产品；CO2培养箱，美国Form

7、e公司产品；超净工作台，苏州净化设备厂产品；显微镜：倒置显微镜，重庆光学仪器厂产品，光学显微镜，XSZ-G型，重庆光学仪器厂产品；低速大容量多管离心机LXJ－HB型，上海安亭科学仪器厂产品；GL－20G－H型高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂产品；TGL－16G型高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂产品；AE240双量程分析天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司产品；酶标仪，美国Bio-Rad公司