细菌源脂肽的规模化制备和bm脂肽毒理及其防治灰霉病药效的研究

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1、＃０２００９０１２３？藤嘗《细菌源脂肽的规模化制备和ＢＭ脂肽ｉ６ｌｆｃＭｚ＠毒理及其防治灰霉病药效的研宄学科专业：发酵工程研究方向：生化分离与分析技术论文作者：顾康博指导教师：李元广教授定稿２０１８４２日期：年月日学位论文使用授权声明Ｉ本学位论文作者完全了解学校有关保留，、使用学位论文的规定同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华东理工大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论文。保密论文在解密

2、后遵守此规定。论文涉密情况：０不保密□保密，保密期（日至年月日）年月＿＿学位论文作者签名：指导老臟名１曰期月曰曰期：年月曰：＞丨＜年午斗＾彳分类号：Ｑ８１９密级：ＵＤＣ：６０６华东理工大学学位论文细菌源脂肽的规模化制备和ＢＭ脂肽毒理及其防治灰霉病药效的研究顾康博指导教师姓名：李元广教授华东理工大学张道敬副研究员华东理工大学申请学位级别：博士专业名称：发酵工程＇论文定稿日期：２０１７．１２．２０论文答辩日期：２０１８．０４．０４学位授予单位：华东理工大学学位授予日期：２０１８

3、．０６答辩委员会主席：宣利江研究员评阅人：薛松研究员卢艳花教授．田黎研宄员高伟工程师作者声明我郑重声明：本人恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导。，师的指导下，独立进行研宄工作所取得的结果除文中明确注明和引用的内容外本论文不包含任何他人己经发表或撰写过的内容。论文为本人亲自撰写，并对所写内容负责。论文繊名：谱？年月口曰丨料斗华东理工大学博士学位论文第Ｉ页细菌源脂肽的规模化制备和ＢＭ脂肽毒理及其防治灰霉病药效的研究摘要６０ｓｗ汾■细菌源脂肽类抗生素于上世纪年代末从枯草芽孢杆菌／／／■？的代谢产物中被发现

4、，在之后的半个世纪中其抗植物病原真菌、细菌、肿瘤等活性研究被大量报道，但迄今细菌源脂肽无法规模化提取与纯化，因此其应用研宄难以开展。本文克服了细菌源脂肽的表面活性与起泡特性对其分离纯化过程的干扰，首先为新“结构且活性好的ＢＭ脂肽建立了经济可行的规模化制备工艺。严格遵循以极性为依据”循序渐进除杂的原则，对酸化沉淀、甲醇浸提、有机溶剂沉淀、盐析、萃取、硅胶柱层析与ＨＺ８０６大孔树脂吸附等成熟且易于放大的分离纯化单元工艺进行试验与优化，考察细菌源脂肽表面活性对这些工艺的影响，逐步去除杂质，建立其规模化制备新工艺，并最终获得高纯度脂肽样品。新工艺从含量为１２０ｍｇ／ＬＢ

5、Ｍ脂肽的海洋芽孢杆菌－－麵咖沿Ｂ９９８７的发酵液中，规模制备了８７．５１１００，％％纯度的ＢＭ脂肽样品收率＞８１．７３％，实现了高纯度细菌源脂肽样品的百克级制备。而且该工艺对原料要求较低，允许发酵阶段使用天然培养基，可从既有芽孢杆菌微生物农药的规模化生产过程中分离纯化其中的脂肽，具有实际应用价值工艺均规避了脂肽水溶液的。各分离纯化单元乳化起泡问题与耗时耗能的水溶液蒸发浓缩过程，经济可行。随后，将ＢＭ脂肽的规模化制备工艺应用于解淀粉芽孢杆菌＇ａｍｊ／ｏ３－２ＢＤ／ｚｇｗ咖ｄｍｓＴＹｇ所产ａｃｉｌｌｏｍｙｃｉｎ脂肽，证实了前者的普适性。结合响应面优化建立了

6、高产８＆６１１〇１１１７匕１１〇的５１＾罐发酵工艺，获得含量为２１．３１％的８３（＾１１〇１１１｝＾１１〇脂肽粗提物；基于此高含量的原料建立了其高纯度样品的可放大制备工艺，所制备样品９４．５７％的纯度可达，收率为６１．４１％，并将分离纯化步骤从优化前的１１步减少至６步，■一步提局了制备效率进。基于规模化制备的ＢＭ脂肽纯化样品，按照我国农药登记要求，对其进行包括急性经口毒性试验、急性经皮毒性试验、急性吸入毒性试验、皮肤刺激试验、眼刺激试验与皮肤变态反应（致敏）试验在内的急性毒理学试验，对其毒力进行了量化，并明确其为低毒化合物。ＢＭ脂肽部分纯化样品防治灰霉病的田间

7、药效试验表明：５００ｍｇ／ＬＢＭ脂肽对灰霉病的防效可达６７．５３％，略逊于常用药剂４００ｍｇ／Ｌ嘧霉胺的７４．０５％与５００ｍｇ／Ｌ异菌脲的７６－．５７％此外，盆栽试验结果表明，ＢＭ脂肽可以显著提升其产生菌５．Ｂ９９８７；６／＞＜－防治黄瓜灰霉病的防效：５０〇１１＾１＾＾［脂肽与３１〇匚？１；／１１１１＾．？＾？７＞？？：６９９８７（芽孢菌剂）混合使用．８，其防效可达８