外源性结缔组织生长因子对人肾小管上皮细胞转分化及

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1、外源性结缔组织生长因子对人肾小管上皮细胞转分化及【摘要】目的：探讨外源性结缔组织生长因子（CTGF）在人肾小管上皮细胞转分化及细胞外基质合成中的作用.方法：将体外培养的人肾小管上皮细胞HK2分为三组：对照组；CTGF小剂量组（终浓度为2.5μg/L）；CTGF大剂量组（终浓度为20μg/L）.用倒置显微镜观察细胞形态学变化；噻唑蓝（MTT）法检测细胞增殖活性；RTPCR检测HK2细胞E钙黏蛋白（Ecadherin），α平滑肌肌动蛋白（αSMA），纤连蛋白（FN）和胶原ⅠαmRNA水平的变化；免疫组织化学方法

2、观察HK2细胞FN和胶原Ⅰ的表达.结果：CTGF刺激使HK2细胞由椭圆形变为梭形，同时促进HK2细胞增殖.不同浓度的CTGF作用于HK2细胞48h后，αSMA和FNmRNA水平显著升高（P<0.05），E钙黏蛋白mRNA的表达显著下降（P<0.05）；大剂量CTGF刺激HK2细胞48h后胶原ⅠαmRNA水平显著升高（P<0.05）.小剂量CTGF组HK2细胞胞质FN表达水平显著增加（P<0.05），大剂量CTGF组HK2细胞胞质表达FN和胶原Ⅰ均显著增加（P<0.05）.结论：CTG

3、F在体外能够诱导人肾小管上皮细胞转分化，并促进FN的合成，大剂量的CTGF可以增加其胶原Ⅰ的合成.【关键词】结缔组织生长因子；肾小管；上皮细胞；转分化；细胞外基质　　大量证据表明，肾小管上皮细胞转分化为间充质细胞（epithelialmyofibroblasttransdifferentiation,EMT）是肾间质纤维化发生机制之一［1］.结缔组织生长因子（connectivetissuegroega）,Taq酶，DNAmaker(TaKaRa),羊抗人胶原ⅠαpAb（1∶200，SantaCruz）,小鼠抗人F

4、NmAb（1∶200，NeoMarkers），HRP标记兔抗羊二抗，HRP标记兔抗小鼠二抗，（1∶200），DAB显色液（武汉博士德公司）；MTT（美国Sigma公司）；图像分析处理系统（美国UVP公司）；聚合酶链反应引物：均由Invitrogen公司合成(表1).表1引物序列（略）　　1.2方法　　1.2.1细胞培养及分组将HK2细胞用含100mL/LFBS的DMEM/F12培养液传代培养，培养条件为37℃，50mL/LCO2.0.5g/L胰酶＋0.2g/LEDTA消化细胞后，1×108/L细胞接种于50mL塑料培

5、养瓶.先以100mL/LFBSDMEM/F12培养细胞，70%～80％融合时改用无血清培养基培养24h，使细胞生长同步化.弃去培养液，将HK2细胞分为三组.对照组：加无血清DMEM/F12培养液；小剂量CTGF组：在无血清DMEM/F12培养液中加入CTGF（终浓度为2.5μg/L）；大剂量CTGF组：在无血清DMEM/F12培养液中加入CTGF（终浓度为20μg/L）.每组设3个复瓶，作用48h后收集细胞.　　1.2.2HK2细胞形态学观察加入各组试剂后，每6h在倒置显微镜下观察细胞形态变化，48h后倒置显微镜下

6、照相.　　1.2.3MTT法将HK2细胞制成悬液，按1×108/L接种于96孔板中，细胞分组同前，每组设6个复孔，刺激48h后MTT比色法测定细胞增殖，以每孔A490nm处吸光度（A）值表示.　　1.2.4RTPCR加入CTGF48h后，按照TRIzol说明书在培养瓶中提取总的RNA，经紫外分光光度计鉴定，取总RNA2μg作逆转录，试验步骤参照逆转录试剂盒说明书进行.取1μL逆转录产物为模板，进行PCR扩增反应.GAPDH反应参数如下：预变性94℃5min,变性94℃30s，退火54℃.E钙黏蛋白（Ecadher

7、in）和纤连蛋白（fibronectin，FN）退火59℃，αSMA和胶原Ⅰα退火63℃,40s，延伸72℃30s，28个循环（Ecadherin，FN，αSMA和胶原Ⅰα32个循环）后，72℃延伸7min.取PCR产物5μL在10g/L琼脂糖凝胶上电泳，凝胶成像系统成像后，用图像分析处理系统进行灰度扫描，以密度代表其表达量.用GAPDH量校正，计算出Ecadherin，αSMA，FN和胶原Ⅰα的相对表达量［3］.重复3次独立的RTPCR全过程.　　1.2.5免疫组织化学细胞爬片制作：将HK2细胞制成悬液

8、，按1×108/L接种于置有波片的6孔板中，培养条件、细胞分组和处理方法同前，48h后收集波片.免疫组化染色：波片冰丙酮固定,TritonX100孵育，0.3mL/L双氧水孵育，兔血清37℃封闭，加一抗，二抗，SABC液孵育，最后DAB显色，苏木素复染，PBS代替一抗做阴性对照.结果判定：以细胞胞浆出现棕黄色颗粒为阳性细胞，采用捷达病理图像分