低表达cbfa1基因的人牙周膜细胞模型的建立及鉴

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1、低表达Cbfa1基因的人牙周膜细胞模型的建立及鉴【摘要】目的：构建针对核心结合因子a1（Cbfa1）的mU6小干扰RNA载体，并将其转染到人牙周膜细胞hPDLCs，观察其干扰效果，以期建立稳定的低表达Cbfa1基因的hPDLCs模型.方法：设计针对Cbfa1基因编码区的寡核苷酸链，体外退火后克隆入经双酶切线性化的小干扰载体mU6中，对重组质粒进行酶切分析和DNA序列测定.以脂质体法将mU6空载体和重组质粒分别导人hPDLCs细胞系.用含G418的培养液筛选，挑取阳性克隆后用RTPCR技术检测各hPDLCs克

2、隆内Cbfa1mRNA水平的表达情况.结果：经酶切鉴定及DNA测序，重组质粒Cbfa1siRNA中插入的目的基因片段与预计片段完全一致.G418筛选转染细胞4U6空载体的细胞克隆株hPDLCsmU6和稳定转染重组质粒的细胞克隆株hPDLCssiRNA.经RTPCR鉴定，Cbfa1在hPDLCssiRNA细胞中的表达比对照细胞明显降低.结论：成功构建了针对Cbfa1的小干扰RNA载体，成功建立了稳定的低表达Cbfa1的hPDLCs模型，为进一步研究Cbfa1的功能奠定了实验基础.【关键词】Cbfa1基

3、因　　0引言　　核心结合因子a1（corebindingfactora1,Cbfa1）是一种成骨分化特异性转录因子，参与了成骨细胞的发生与分化，对维持骨的生长发育起着关键作用［1-4］.研究［5-7］发现，Cbfa1在牙齿发育过程中呈保守表达，可能是牙齿发育和矿化的重要转录调控因子，在牙齿发育过程中发挥重要作用.我们以人牙周膜细胞（hPDLCs）为对象,建立了低表达Cbfa1的细胞模型，为进一步研究Cbfa1的功能奠定了实验基础.　　1材料和方法　　1.1材料hPDLCs引自美国典型培养物保存中心(ATCC)

4、；mU6载体为美国Michigan大学医学院Tumer教授赠送；T4DNA连接酶、各种限制性内切酶（TaKaRa公司）；脂质体转染试剂Lipofectamine2000（美国Invitrogen公司）；RPMI1640，G418（Gibco公司）；RNA抽提试剂盒（上海华舜公司）.　　1.2Cbfa1siRNA载体的构建根据GenBankCbfa1基因的已知序列设计其siRNA的序列：上游引物：5′tttgcggagtagttctcgtcatacaatgacgagaactactccgcttttt3′,下游

5、引物：5′ctagaaaaagcggagtagttctcgtcattgtatgacgagaactactccg3′.上述序列用BLAST软件进行同源分析证实为Cbfa1高度保守后，由Sangon公司合成.退火后酶切mU6质粒，行10g/L琼脂糖凝胶电泳，回收线性化载体，将退火产物和回收产物定量后于16℃连接16h，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细菌.37℃培养12～18h.挑选单克隆扩增后进行酶切鉴定和DNA测序.　　1.3细胞培养与转染将hPDLCs常规培养于100mL/LRPMI1640培养液中

6、.G418筛选浓度的确定：将hPDLCs接种于6孔板（2×105/孔）.G418按100，200，300，400，500，600，700，800mg/L的终浓度加入各孔细胞，观察细胞生长状况，以第8日细胞全部死亡的最低浓度为筛选浓度.确定筛选浓度为300mg/L.取对数生长期hPDLCs，接种于6孔板（5×105/孔），在50mL/LCO2培养箱中过夜，直至细胞80%饱和.在1mLRPMI1640培养液中加10μg质粒（分别加入重组质粒mU6Cbfa1，空载体mU6）振荡混匀，加入lipofectinami

7、ne脂质体悬液10μL，室温温育15min.弃去培养基,用无血清培养基洗2次,逐滴缓慢加入预先制备的质粒ＤＮＡ/脂质体复合液,37℃，50mL/LCO2培养箱中温育5h后补充1mL200mL/L新生牛血清的RPMI1640培养液，继续培养.30h后改用含G418300mg/L的培养液筛选，挑取阳性克隆并进行扩增培养.设立mU6空载体转染细胞作为对照.阳性克隆株分别命名为hPDLCssiRNA和hPDLCsmU6细胞，以RTPCR进行鉴定.　　1.4RTPCR用RNA抽提试剂盒提取细胞总RNA并定量，取

8、10μg的总RNA和OligodT(15)4μL进行反转录，于70℃10min后置于冰上，再依次加入5×Buffer10μL，dNTP2μL，AMV1μL，RNasin1μL，去离子水补至50μL，42℃孵育2h后冰冻保存.常规进行PCR扩增，反应引物Cbfa1:5′cacctcggaactgaacccat3′和5′gcctccacgccatcactct3′；βactin:5′agcgg