与人遗传病相关的三核苷酸重复序列(gaa)n·(

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1、与人遗传病相关的三核苷酸重复序列(GAA)n·(【摘要】目的:研究含重复序列(GAA)n·(TTC)n的菌体在传代培养中氨苄青霉素对其遗传突变的影响。方法:采用分子克隆、PCR等分子生物学实验技术。结果：在100mLLB液体培养基中加入100mg/mL氨苄青霉素35μL对重复序列有明显删减。结论：治疗与重复序列相关的神经系统遗传疾病可以通过促进重复序列的有效删减，将重复序列数目控制在阈值之内来完成。【关键词】遗传病;重复序列;自然突变　AbstractObjective：Toexploretheimpact

2、ofampicillinongeicmutationsof(GAA)n·(TTC)nrepeatsequencebacteriainthepassageculture.Methods:Molecularcloning,PCRandothermolecularbiologicaltechniquesg/mlampicillin35μladdedto100mlLBliquidmediumremarkablydeletedtherepeatsequences.Conclusion:Treatmentofgeicd

3、iseasesofnervoussystemassociatedotingtheeffectivedeletionofrepeatsandkeepingthenumberofrepeatsutation　　迄今为止近40种神经系统遗传病的发生可能与三核苷酸重复序列的扩增有关[1]，如弗里德赖希共济失调与重复序列(GAA)n·(TTC)n的大量扩增有关[2]。正常人体内存在一定的重复序列，重复序列达到一定数目以上才会引起疾病。治疗与重复序列相关的神经系统遗传疾病的可行性方案是抑制重复序列的扩增或促进重复序列的

4、有效删减，将重复序列数目控制在阈值之内，这对生物学研究及临床医学有非常重要的意义。　　1材料与方法　　1.1材料　　1.1.1生物材料与试剂　　大肠杆菌DH5α、pUC19质粒均为内蒙古大学实验室提供，含有重复序列(GAA)28的大肠杆菌、限制性核酸内切酶(BamHⅠ、EcoRⅠ、PvuⅡ)、T4噬菌体多核苷酸激酶、RNaseA、T4DNA连接酶均购自TaKaRa公司，PleI酶购自NEB公司，质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购于天根公司。其他试剂为国产(分析纯)。　　1.1.2实验仪器　　高速冷

5、冻离心机(Eppendorf5810R)，凝胶成像仪(GENE-GENIUS)，紫外-可见分光光度(Nanodrop)计，槽体冷却加热器(PHC-19型)，台式离心机(TGL-16C)，超纯水仪(Bioscience-UBL214715)，电热恒温培养箱(DHP-9272)。　　1.2方法　　1.2.1克隆策略　　化学合成寡核苷酸重复序列(GAA)7、(TTC)7，经磷酸化、杂交后与接头EP1/2、PB1/2以1∶5∶2(EP1/2∶重复序列∶PB1/2)做酶连反应，酶连产物经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后

6、插入到克隆载体pUC19质粒中，转化进入大肠杆菌DH5α株型，在含有氨苄的平板上筛选重组子[3]。按常规方法进行细菌的培养以及质粒的小量制备，PvuⅡ酶切后电泳检测插入重复序列片段的大小。同时在接头中设计了PleI酶切位点，用PleI酶切重组质粒得到的小片段就是纯粹的插入序列。EcoRⅠ和BamHⅠ酶切重组质粒得到的片段就是25bp加上纯粹的插入序列。由此策略得到重复序列(GAA)28·(TTC)28。　　1.2.2自然遗传突变研究实验步骤　　用接种环挑取冻存菌体(GAA)28·(TTC)28在LB固体平板

7、上划线，恒温培养箱中37℃过夜培养以获得单菌落。用接种环挑取单菌落接入8mL含氨苄青霉素(AMP)的LB液体培养基中，共3组，所加AMP(100mg/mL)的体积分别为为30μL、35μL、40μL。每组3个平行实验，37℃恒温培养振荡器培养，观察第一代菌体的生长情况。约7～8h后用紫外分光光度计测得OD650为0.6左右，视为菌体生长的最佳状态。取200μL菌液加到8mLLB液体培养基中，摇第二代菌，37℃恒温培养振荡器培养，4～5h保存菌体。在同样条件下，用同样的方法传代培养得到第七代菌体。对第一、三、

8、五、七代菌体提取质粒DNA。　　为了检测菌体在传代培养中AMP对遗传突变的影响，我们对第一代、第七代的部分质粒DNA进行PCR扩增检测，再用5%的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物，结果见图2。　　PCR扩增：(1)模板：含有(GAA)28·(TTC)28的质粒DNA。(2)反应体系：采用25μL体系，buffer加2.5μL,Taq聚合酶加0.3μL，根据模板的浓度不同模板加入的量不同。体系中引物EP1、PB2的原