再生丝素蛋白及构象转变离子效应的核磁研究

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1、再生丝素蛋白及构象转变离子效应的核磁研究　　摘要：通过NMR测试技术研究了再生桑蚕丝素蛋白在水溶液中的分子结构及在有镁离子效应时的构象转变情况。研究表明NMR显示，再生丝素蛋白的构象主要为无规线团，而加入离子后主要为β折叠构型。Mg离子通过与丝素蛋白的羰基和氨基间的键合作用诱导丝素蛋白向更规则的β折叠转化。　　关键词：丝素蛋白NMR离子效应构象转变　　从元素上看，丝素蛋白除含C，H，O，N外，还含有K，Cu，Mg等多种元素，这些无机金属离子在生命体系中发挥着不可或缺的作用。研究表明这些金属离子在成丝过程中能促进丝纤维的形成[1]。

2、通过拉曼和固体核磁等方法证实K和Cu等离子对丝素蛋白构象转变的影响[1，2]。　　NMR在分子及宏观水平上提供了丰富的方法来研究生物大分子结构和功能[3]。Asakura[4]等用核磁共振实验证明了再生丝素和腺体中的丝素蛋白溶液具有类似的构象。这里我们报道了再生丝素蛋白氘代溶液的CNMR核磁谱。相对固态NMR有较高分辨率和窄的线宽[5]，通过参考对Nephilaedulis拖丝NMR的指认对桑蚕丝素蛋白碳谱进行了指认，同时基于对再生丝素蛋白的指认，通过用CNMR考察了Mg离子的加入对丝素蛋白构象转变的影响。　　1.实验部分　　1.

3、1丝素蛋白粉的制备4　　丝素脱胶：将市购的桑蚕茧去蛹并剥成片状、剪成约1cm的碎片后，放入保持沸腾状态，质量比为0.5%的NaCO水溶液中进行脱胶处理，蚕茧与水溶液的质量比为1∶100。半小时后，将已成丝状的蚕茧捞出并拧干。重复上述操作一次后，用去离子水将脱胶好的蚕丝清洗至无滑腻感并吹干。50℃烘干，得脱胶丝素。目的：脱去蚕茧中得丝胶蛋白及一些杂质。　　丝素溶解：50%的氯化钙溶液加热至沸，将干燥的脱胶丝素加入（w/v=1：25～50），搅拌，使丝素充分溶解、冷却、过滤，滤液装入透析袋（截留分子量为8000～12000）中，放入装

4、有10倍于丝素溶液体积的去离子水中透析，每4h左右换一次水，3天后透析结束。这样就得到了浓度很低的丝素溶液。将装有丝素溶液的透析袋放于室温下蒸发（最好用风扇吹），使大多数水分蒸发，得到浓度较高的丝素溶液。经准确测量得到的丝素溶液浓度为0.07g/mL，这种溶液作为储存溶液，其他浓度的溶液由这一溶液稀释得到。在样品制备中，要避免强烈搅拌和震荡，以防引起构象的变化。将制得的较高浓度的丝素溶液冷冻干燥即可得丝素粉。　　1.2离子效应的固体样品制备　　取5mL原丝素蛋白溶液再取1.68mL7×10mol/L的MgCl的溶液，混合反应1h后

5、冷冻干燥（因为丝素蛋白在高温干燥时会变性，室温下干燥影响水溶性而难以做NMR测试，所以采用冷冻干燥），得干燥的固体样品。　　1.3核磁共振测定　　本文的NMR谱图是在瑞士Brucker公司出厂的400MHz超导核磁共振波谱仪（AVANCEAV400MHzDigitalFT-NMRSpectrometer）上获得的。本实验以氘代水做溶剂，化学位移参照外标TMS方法。4　　2.结果与讨论　　2.1再生桑蚕丝素蛋白中氨基酸的指认　　天然同位素丰度的再生桑蚕丝素蛋白CNMR谱如图1所示。谱图显示了从蛋白质侧链和骨架引起的共振。由于没有同核

6、J偶合，谱峰很窄，因此能对各不同氨基酸引起的自旋共振进行指认。天然同位素丰度的丝素蛋白CNMR谱的指认可以通过用全C标注特定氨基酸的液态丝素做单脉冲实验而得到。如标注丙氨酸时，用C的丙氨酸喂食蜘蛛，其产生的C标注了的丙氨酸嵌段丝素蛋白的CNMR通过对照自然丰度的蛋白质CNMR谱，共振强度明显增高的峰就是属于C标注了的丙氨酸嵌段。　　图1再生桑蚕（Bombyxmori）丝素蛋白质子去偶CNMR谱图　　2.2加Mg离子的核磁谱图分析　　再生桑蚕丝素蛋白的各主要氨基酸嵌段的C和C化学位移基本都落在β折叠的二级结构区间，加入Mg后，丝素蛋

7、白各项氨基酸的C发生了位移，化学位移普遍向高场移动，具体表现如下：丙胺酸，甘氨酸，丝氨酸C及酪氨酸的C都由原来的无规线团变化为β折叠的区间范围内；亮氨酸的C在离子作用前后变化不大，但也向高场移动，落入β折叠的区间。丙胺酸的C由原来的β折叠区间移动到α螺旋结构范围，丝氨酸的C在α螺旋范围内（实验数据和文献有一定的偏差，我们大致可以根据接近哪个范围来判断）。从总体看，Mg处理的丝素蛋白C有从无规线团向β折叠转化的趋势，因此可以认为，加入Mg离子后，丝素蛋白构象由SilkⅠ结构向SilkⅡ结构转化，如图2所示。　　图2Mg离子处理过的再

8、生桑蚕（Bombyxmori）丝素蛋白质子去偶4CNMR谱图　　3.结论　　通过对再生桑蚕丝素蛋白在水溶液中的CNMR核磁谱的分析，以及加入Mg离子的CNMR核磁谱的分析，得到C的指认。同时通过对照最常见五种氨基酸嵌段的不同二级结构CNMR化学位移