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时间:2018-11-02
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1、姜黄素诱导人结肠癌细胞株SW480凋亡及其bcl【摘要】探讨姜黄素对人结肠癌细胞株STT法检测细胞的生长活性,流式细胞仪检测细胞周期,TUNEL法检测细胞凋亡,免疫组化法检测细胞内bcl2蛋白表达水平。结果MTT显示姜黄素对S结果显示细胞周期中G0/G1期细胞比例增加,S期、G2/M期比例下降。TUNEL法显示凋亡细胞数增加,免疫组化结果显示bcl2基因表达明显减弱。结论姜黄素能抑制结肠癌STT(噻唑蓝)为美国Sigma公司产品。小牛血清、RPMI1640为美国GIBCO公司产品。细胞凋亡原位检测试剂盒为德国BoehringerMannheim公司产品。bcl
2、2免疫组化试剂盒为武汉博士德公司产品。 1.2方法 1.2.1细胞培养SI1640培养基,37℃、5%CO2培养箱中常规传代培养。设对照组和实验组,并根据实验要求加入不同浓度的试剂。 1.2.2噻唑蓝还原法(MTT法)检测细胞生长抑制率取对数生长期细胞5×104个/ml,每孔0.2ml,接种于96孔组织培养板中,设PBS对照组和不同浓度(5~50μmol/L)的实验组,各设3个复孔。置37℃、5%CO2培养箱中培养,分别作用6h、12h、24h、48h,实验终止前4h每孔加MTT(5mg/ml)工作液20μl,上机前除去培养液,每孔加200μl二甲基亚砜,
3、在酶标仪(570nm波长)上测量各孔吸光度值(OD值),按下列公式计算细胞生长抑制率。 抑制率(%)=(1-实验组平均OD值/对照组平均OD值)×100% 1.2.3流式细胞仪检测细胞周期消化收集各实验组及对照组分别培养24h的细胞,调整细胞悬液浓度为1×106/ml,上流式细胞仪分析。用multicycleDNA分析软件进行细胞周期的测定。 1.2.4TUNEL法检测细胞凋亡操作步骤按试剂盒说明进行。结果判定:细胞核染为棕黄色的细胞被判定为凋亡细胞。随机选取5个高倍视野(400倍),分别计数凋亡细胞数和细胞总数,计算凋亡指数(apoptosisindex,
4、AI)。 AI=(凋亡细胞数/细胞总数)×100% 1.2.5免疫组化法检测bcl2的表达按照SABC试剂盒使用说明书操作。显色后用图像分析仪进行图像分析。随机测定100个细胞,测出阳性反应细胞的总面积(Area)和积分光密度(IOD),然后求出平均光密度(Dλ)值。 1.2.6统计学分析实验数据以±s表示,进行方差分析。 2结果 2.1姜黄素对S期最少。对照组DNA组方图为典型肿瘤细胞的G0/G1、S、G2/M峰型。从表2可以看出,细胞周期发生明显变化。G0/G1期比例降低,S期、G2/M期比例均增高,呈剂量依赖关系。提示姜黄素可阻断癌细胞从G0/G
5、1期到S期的发展。 2.3TUNEL法检测细胞凋亡结果显示,光镜下阳性细胞及凋亡细胞核染成棕黄色,细胞由梭形变成圆形,细胞皱缩,细胞核固缩,核碎裂等。由表3可以看出,姜黄素可诱导癌细胞凋亡,且呈剂量依赖关系,且各浓度组间差异具有显著性(P<0.05),见图1。 表2姜黄素对STT法发现姜黄素对S期细胞比例明显减少,说明细胞生长被阻滞于S期和G2/M期,并且此作用同样具有浓度依赖性。Mehta等[5]报道,以姜黄素处理的数株人乳腺癌细胞均可发生G2/M期停滞,但未观察到细胞周期蛋白(cyclin)B的明显变化。经姜黄素处理的人结肠癌细胞HT29和HCT15
6、也同样发生G2/M期停滞[6]。而许建华等[7]的研究表明姜黄素处理的人肝癌细胞BEL7402则发生S期停滞。这些结果表明,对于不同组织类型的癌细胞来说,姜黄素对细胞周期的调控可能存在不同的机制。本实验结果表明,姜黄素具有直接杀伤肿瘤细胞的作用,其干扰细胞周期使阻断于S期和G2/M期可能是姜黄素抗癌作用的重要机制。 肿瘤的发生与细胞凋亡的异常有密切关系,肿瘤细胞凋亡是一个多基因参与调控的复杂过程,凋亡可使肿瘤细胞主动性自杀性死亡。其中bcl2家族是其中最重要的基因之一,其编码的蛋白能抑制细胞凋亡。bcl2通过许多刺激因素如神经营养和增长因子的缺乏、Ca++渗
7、透、热休克、辐射和某些病毒等而阻止细胞死亡,可导致DNA受损的细胞持续生存、突变产物聚集,从而促进肿瘤的发生发展。它调节细胞凋亡的作用点可能是影响线粒体释放细胞色素C[8]。姜黄素能显著诱导Hras转化的人乳腺上皮细胞MCF10A细胞凋亡,并在mRNA和蛋白水平下调bcl2基因的表达[9]。Miyashita发现bcl2蛋白能抑制抗肿瘤药物诱导的细胞凋亡[10]。实验结果表明,姜黄素能诱导SM,etal.CurcuminpreventsintravesicaltumorimplantationoftheMBT2tumorcelllineinC3Hmice[
8、J].JU
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