pcr技术克隆sd大鼠全长长细胞内段形式瘦素受体

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1、PCR技术克隆SD大鼠全长长细胞内段形式瘦素受体【摘要】目的：探讨瘦素作用机制、了解瘦素及瘦素受体对代谢的影响，为下一步实验，表达重组体的构建提供了方便。方法：以逆转录多聚酶链扩增（RTPCR）克隆长细胞内段形式瘦素受体（OBRb）基因cDNA。结果：成功克隆长细胞内段形式瘦素受体（OBRb）基因cDNA。结论：为进一步研究瘦素与瘦素的生理作用和作用机制的系列研究打下实验基础。【关键词】瘦素；瘦素受体；逆转录多聚酶链扩增　　RTPCRCloningforOBRbcDNAGeneofLeptinReceptori

2、nLongIntracellularDomain　　　　Abstract:ObjectiveToappraiseeffectprinciplesofLeptinandstudytheinfluenceofmetabolismbyLeptinandLeptinReceptor,sothatitcanoffertheconvenienceofrebinantconstructioninthefurtherexperiment.MethodsRTPCRClonesforOBRbcDNAGeneofLeptinRecep

3、torinLongIntracellularDomain.ResultsItsucceedstocloneforOBRbcDNAGeneofLeptinReceptorinLongIntracellularDomain.ItlaysaexperimentfoundationforthestudyingofphysiologicaleffectandstructureofLeptinandLeptinReceptor.　　　　Key购自Roche公司，QiaquickGelExtractionKit和PlasmidQ

4、iaprepSpinMiniprepKit购自QIAGEN公司，琼脂糖、pMD18T和限制性内切酶XbaⅠ、SmaⅠ、SphⅠ、EcoRV、HincⅡ、T4DNA连接酶购自TakaRaBiotech公司，JM109由本院林百欣医学实验中心提供。　　1.1.3主要仪器紫外分光光度仪（日本岛津），PCR仪（BarnstaedThermolyne，USA），高速低温离心机（Htelich，Universal32R，American），台式离心机（Eppendorf），凝胶成像（上海复旦），37℃恒温水浴箱（SHZ88台

5、式水浴恒温振荡漾器），低温水浴箱（HoeferRCB500）。　　1.2方法　　1.2.1引物设计根据计算机软件设计,包含了OBRb基因的部分细胞外段、跨膜段和长细胞内段编码区，全长1355bp。为了方便构建重组质粒时与载体的连接，分别其在上游（21332158）和下游引物（34893465）的5＇端加上XbaⅠ、SmaⅠ的限制性酶切位点，引物序列为：5＇GGTCTAGATTCTGGCCATCAATTCCATCGGTGC3＇5＇CTCCCGGGTTACACAGTTAAGTCACACATCTT3＇引物由T

6、akaraBiotech公司合成（下画线的部分为酶切位点）。　　1.2.2SD大鼠下丘脑总RNA的制备腹腔内注射戊巴比妥钠（按35mg/kg体重）麻醉大鼠,取下丘脑组织，立即置于装有裂解液的试管内，用Rotorstator匀浆器把下丘脑组织磨碎并匀浆，按RneasyMiniKit操作步骤抽提总RNA，测定OD值并电泳，以判断抽提的RNA质量。　　1.2.3RTPCR总RNA1μg、10倍逆转录反应缓冲液2μl、MgCl2100mmol、4种单核苷酸各20mmol、序列特异性引物75poml、RNA酶抑制剂50U、

7、AMV逆转录酶20U，加无菌水使反应体积达20μl、42℃孵育1h进行逆转录反应，99℃5min使酶失活。为了扩增OBRbcDNA片段，在一个50μl的反应体系中进行PCR，并对反应体系中cDNA、引物和MgCl2量、退火温度、退火时间、适伸时间以及反应的循环次数进行了优化，最终反应体系中包含10倍PCR反应缓冲液5μl、4种单核苷酸各10mmol、MgCl2100mmol、上下游引物各17poml、cDNA1μl、酶混合物2.6U，94℃孵育1min后，以94℃30s、62℃45s、72℃100s反应条件扩增30

8、个循环。扩增产物电泳后照相，按QiaquickGelExtracionKit操作说明回收目的DNA，紫外分光光度法测定其含量，并经SphI酶切初步鉴定。　　1.2.4携有OBRbcDNA片段的重组质粒（pMD180BRb）的构建及鉴定上述回收的扩增产物和质粒pMD18T进行连接；转化感受态大肠杆菌JM109，通过蓝白斑筛选出阳性菌落；再经限制性酶切和PCR初