PCR技术克隆SD大鼠全长长细胞内段形式瘦素受体基因cDNA.doc

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1、PCR技术克隆SD大鼠全长长细胞内段形式瘦素受体基因cDNA【摘要】目的：探讨瘦素作用机制、了解瘦素及瘦素受体对代谢的影响，为下一步实验，表达重组体的构建提供了方便。方法：以逆转录多聚酶链扩增（RTPCR）克隆长细胞内段形式瘦素受体（OBRb）基因cDNA。结果：成功克隆长细胞内段形式瘦素受体（OBRb）基因cDNA。结论：为进一步研究瘦素与瘦素的生理作用和作用机制的系列研究打下实验基础。【关键词】瘦素；瘦素受体；逆转录多聚酶链扩增　　RTPCRCloningforOBRbcDNAGeneofLeptinRece

2、ptorinLongIntracellularDomain　　　　Abstract:ObjectiveToappraiseeffectprinciplesofLeptinandstudytheinfluenceofmetabolismbyLeptinandLeptinReceptor,sothatitcanoffertheconvenienceofrecombinantconstructioninthefurtherexperiment.MethodsRTPCRClonesforOBRbcDNAGeneofLept

3、inReceptorinLongIntracellularDomain.ResultsItsucceedstocloneforOBRbcDNAGeneofLeptinReceptorinLongIntracellularDomain.ItlaysaexperimentfoundationforthestudyingofphysiologicaleffectandstructureofLeptinandLeptinReceptor.　　　　Keywords:Leptin;LeptinReceptor;RTPCR　　肥

4、胖症的分子发病机制多年来一直不清楚，1994年瘦素基因（OB基因）和1995年瘦素受体（OBR基因）的成功克隆［1,2］，使肥胖的分子发病机制研究进入了新的时代。目前已知瘦素与瘦素受体结合，通过下丘脑中枢和外周组织两条途径，经一系列机制降低食欲、调节能量代谢及维持体重平衡，并参与糖、脂肪的代谢调节。体内瘦素受体蛋白存在多种异构体，它们的生理作用和作用机制未完全明确，目前认为长细胞内段式瘦素受体是介导瘦素作用的主要形式，但细胞内段形式瘦素受体的功能意义尚不清楚。为探讨瘦素作用机制,了解瘦素及瘦素受体对代谢的影响，本实验

5、仅介绍通过逆转录多聚酶链扩增（RTPCR）克隆全长长细胞内段形式瘦素受体（OBRb）基因cDNA。　　1材料与方法　　1.1材料　　1.1.1实验动物正常SD大鼠，体重约250g，购自中山医科大学动物实验中心。　　1.1.2主要试剂RNeasyMiniKit购自QIAGEN公司，FirstStrandcDNA4SynthesisKitforRTPCR（AMV）和ExpandTMHighFidelityPCRSystem购自Roche公司，QiaquickGelExtractionKit和PlasmidQiapre

6、pSpinMiniprepKit购自QIAGEN公司，琼脂糖、pMD18T和限制性内切酶XbaⅠ、SmaⅠ、SphⅠ、EcoRV、HincⅡ、T4DNA连接酶购自TakaRaBiotech公司，JM109由本院林百欣医学实验中心提供。　　1.1.3主要仪器紫外分光光度仪（日本岛津），PCR仪（BarnstaedThermolyne，USA），高速低温离心机（Htelich，Universal32R，American），台式离心机（Eppendorf），凝胶成像（上海复旦），37℃恒温水浴箱（SHZ88台式水浴恒温振

7、荡漾器），低温水浴箱（HoeferRCB500）。　　1.2方法　　1.2.1引物设计根据计算机软件设计,包含了OBRb基因的部分细胞外段、跨膜段和长细胞内段编码区，全长1355bp。为了方便构建重组质粒时与载体的连接，分别其在上游（21332158）和下游引物（34893465）的5＇端加上XbaⅠ、SmaⅠ的限制性酶切位点，引物序列为：5＇GGTCTAGATTCTGGCCATCAATTCCATCGGTGC3＇5＇CTCCCGGGTTACACAGTTAAGTCACACATCTT3＇引物由TakaraBi

8、otech公司合成（下画线的部分为酶切位点）。　　1.2.2SD大鼠下丘脑总RNA的制备腹腔内注射戊巴比妥钠（按35mg/kg体重）麻醉大鼠,取下丘脑组织，立即置于装有裂解液的试管内，用Rotorstator匀浆器把下丘脑组织磨碎并匀浆，按RneasyMiniKit操作步骤抽提总RNA，测定OD值并电泳，以判断抽提的RNA质量。　　1.2.3R