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HPLC法测定不同外植体诱导虎杖愈伤组织中大黄素【摘要】：目的通过HPLC法考察不同外植体对虎杖愈伤组织中大黄素含量的影响。方法选取MS＋6-BA0.2mg/L＋KT0.2mg/L＋2,4-D0.5mg/L为培养基,分别以虎杖的叶片、茎段、叶柄为外植体,诱导出愈伤组织；采用Diamonsil-C18(250mm×4.6mm,5μm)色谱柱；流动相：甲醇-0.1%磷酸(80∶20)；检测波长：254nm；流速：1.0mL/min；柱温：27℃；进样量：20μL。结果由叶片、茎段、叶柄所诱导的愈伤组织中大黄素含量分别为0.7096、1.6800、0.1668mg/g,大黄素在0.25～5μg/mL浓度范围内线性关系良好,r=0.99985,平均加样回收率为101.19%,RSD＝1.20%。结论HPLC法可用于愈伤组织中大黄素的含量测定,且由茎段所诱导的愈伤组织中大黄素含量较高。【关键词】虎杖 外植体 愈伤组织 大黄素 高效液相色谱法 Abstract：ObjectiveToinvestigatetheeffectofdifferentexplantsonemodincontentsinthecallusofPolygouumcuspidatumbyreverse-phaseHPLC.MethodsTheleafs,stemsandleafstalksof Polygouumcuspidatumediumcontaining6-BA0.2mg/L,KT0.2mg/Land2,4-D0.5mg/L.ThecontentsofemodinedonDiamonsil-C18(250mm×4.6mm,5μm)column,usingmethanol-0.1%H3PO4(80∶20)asmobilephase,detectedat254nm.ThefloL/min,thecolumntemperatureoding/ginthecallusinducedbyleafs,stemsandleafstalks.ThelinearrangeofemodinL,r＝0.99985,theaveragerecoveryethodcouldbeusedforthecontentsdeterminationofemodininPolygouumcuspidatumcallusandthecontentsofemodins. Keycuspidatum；explant；callus；emodin；HPLC 目前药用植物细胞培养技术发展迅速,已从被研究的400多种植物细胞中分离出600多种次生代谢产物,其中有60多种在含量上超过或等于原植物[1],因此,利用细胞工程技术生产有用的次生代谢物质具有广阔的前景。虎杖(PolygonumcuspidatumSieb.et Zucc.)是蓼科蓼属多年生灌木状草本植物虎杖的干燥根茎和根,性苦寒,归肝、肺、胆经,具有祛风利湿、祛痰止咳、清热解毒、活血化瘀之效。中医临床用于治疗湿热黄疸、肺热咳嗽、疮痈肿毒、关节痹痛、经闭经痛[2]。其根茎富含大黄素、虎杖苷、白藜芦醇等多种活性成分。药理学研究表明,其主要活性成分大黄素具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、平喘等多种功效[3]。本实验通过对虎杖叶片、茎段、叶柄3种不同外植体诱导出愈伤组织,并采用HPLC法测定愈伤组织中大黄素的含量,研究不同外植体对愈伤组织中大黄素含量的影响,从而为利用细胞工程方法生产大黄素提供一定的实验依据。 1仪器与材料 Agilent1100series高效液相色谱仪；色谱柱：Diamonsil-C18(250mm×4.6mm,5μm)；Agilent色谱化学工作站。 大黄素对照品(中国药品生物制品检定所提供,供含量测定用,批号756-9203)；虎杖愈伤组织为安徽省中药研究与开发重点实验室自行培养。甲醇为色谱纯；水为重蒸水；其余试剂均为分析纯。 2方法与结果 2.1愈伤组织培养[4] 选取健壮无病的虎杖植株,取其叶片、茎段、叶柄,用自来水冲洗干净。晾干后,在超净工作台内用75%酒精消毒30s,无菌水冲洗1次,然后用0.1%HgCl2溶液消毒8min,再用无菌水冲洗5次,每次5 min,置无菌滤纸上晾干,切成0.5cm×0.5cm的小块,接种在MS＋6-BA0.2mg/L＋KT0.2mg/L＋2,4-D0.5mg/L培养基中,温度(25±1)℃培养,30d后收获愈伤组织,60℃下烘干备用。 2.2色谱条件的选择及测定 2.2.1色谱条件[5] 色谱柱：Diamonsil-C18(250mm×4.6mm,5μm)；流动相：甲醇-0.1%磷酸(80∶20)；检测波长：254nm；流速：1.0mL/min；柱温：27℃；进样量：20μL。在上述条件下,大黄素可与其它组分达到基线分离,见图1。 2.2.2对照品溶液的配制 精密称取大黄素对照品1.0mg,以甲醇溶解并定容至10mL,摇匀,配成100μg/mL的溶液。 2.2.3供试品溶液的制备[5] 选取由叶片、茎段、叶柄不同外植体诱导的虎杖愈伤组织干燥研细,过60目筛,精密称取约0.1g,加入三氯甲烷25mL和2.5mol/L硫酸溶液20mL,称定重量,置80℃水浴回流2h,冷却后,称重,用三氯甲烷补足失重,摇匀,水浴蒸干,残渣用1mL甲醇溶解,用0.45μm微孔滤膜过滤,备用。 2.2.4线性关系试验 取100μ g/mL的对照品溶液用甲醇稀释为5、2.5、1.25、0.5和0.25μg/mL,进样量为20μL,以对照品峰面积Y为纵坐标,以进样浓度(μg/mL)Ｘ为横坐标进行线性回归,得回归方程为：Y＝83587X－0.1148(r＝0.99985)。表明大黄素在0.25～5μg/mL浓度范围内线性关系良好。 2.2.5精密度试验 精密吸取同一对照品溶液(5μg/mL)20μL,重复进样5次,测定大黄素的峰面积值,RSD＝0.71%,表明仪器精密度良好。 2.2.6稳定性试验 将待测样品溶液在室温下贮存,在相同的色谱条件下,每隔2h进样1次,共5次(n＝5),测定大黄素的峰面积值,RSD＝0.91%,表明该样品溶液在10h内基本稳定。 2.2.7重复性试验 取同一供试样品5份(n＝5),每份0.1g,精密称取,按“2.２.3”项中的方法处理,残渣用0.1mL甲醇溶解,测定大黄素的峰面积值,结果大黄素峰面积值RSD＝1.37%,表明重现性良好。 2.2.8加样回收率试验 采用加样回收法。精密称取已知含量(4.165μg/mL)的样品,分别精密加入一定量的大黄素(5.000μg/mL)对照品,按“2.2.1” 项的色谱条件依法测定峰面积,计算回收率。结果平均回收率为101.19%,RSD＝1.20%。结果见表1。表1加样回收率试验测定结果(略) 2.2.9含量测定 精密称取干燥愈伤组织粉碎品,按“2.2.3”所述方法制备供试品溶液,吸取20μL供试品溶液注入高效液相色谱仪,测定含量。结果见表2。表2样品中大黄素含量测定结果（略）注：大黄素含量均为3次样品测定的平均值 3讨论 由于野生资源的不断匮乏,利用植物组织培养技术来获得次生代谢产物有着广泛的前景。通过本实验所选取的培养条件可成功培养出虎杖的愈伤组织,运用HPLC法检测表明在人工条件下培养的愈伤组织中含有大黄素,其中以茎段诱导愈伤组织中大黄素的含量最高,而由叶片、叶柄的愈伤组织中较低,这可能与不同器官次生代谢的能力不同有关[6]。 在HPLC法检测过程中,我们选用《中华人民共和国药典》收录的色谱条件对虎杖的3种不同的愈伤组织产生大黄素进行提取及含量测定,由图1可知,在该条件下分离的大黄素峰形较好,无拖尾现象,出峰时间为17.56min。 本实验的结果为利用组织培养技术筛选大黄素高产植株进行了初步研究,为进一步开展大黄素工业化生产提供理论空间和实验依据。【
