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1、HPLC法测定不同外植体诱导虎杖愈伤组织中大黄素含量【摘要】：目的通过HPLC法考察不同外植体对虎杖愈伤组织中大黄素含量的影响。方法选取MS＋6-BA0.2mg/L＋KT0.2mg/L＋2,4-D0.5mg/L为培养基,分别以虎杖的叶片、茎段、叶柄为外植体,诱导出愈伤组织；采用Diamonsil-C18(250mm×4.6mm,5μm)色谱柱；流动相：甲醇-0.1%磷酸(80∶20)；检测波长：254nm；流速：1.0mL/min；柱温：27℃；进样量：20μL。结果由叶片、茎段、叶柄所诱导的愈伤组织中大黄素含量分别
2、为0.7096、1.6800、0.1668mg/g,大黄素在0.25～5μg/mL浓度范围内线性关系良好,r=0.99985,平均加样回收率为101.19%,RSD＝1.20%。结论HPLC法可用于愈伤组织中大黄素的含量测定,且由茎段所诱导的愈伤组织中大黄素含量较高。【关键词】虎杖 外植体 愈伤组织 大黄素 高效液相色谱法 Abstract：ObjectiveToinvestigatetheeffectofdifferentexplantsonemodincontentsinthecallusofPolygouum
3、cuspidatumbyreverse-phaseHPLC.MethodsTheleafs,stemsandleafstalksofPolygouumcuspidatumediumcontaining6-BA0.2mg/L,KT0.2mg/Land2,4-D0.5mg/L.ThecontentsofemodinedonDiamonsil-C18(250mm×4.6mm,5μm)column,usingmethanol-0.1%H3PO4(80∶20)asmobilephase,detectedat254nm.Thef
4、loL/min,thecolumntemperatureoding/ginthecallusinducedbyleafs,stemsandleafstalks.ThelinearrangeofemodinL,r＝0.99985,theaveragerecoveryethodcouldbeusedforthecontentsdeterminationofemodininPolygouumcuspidatumcallusandthecontentsofemodins. Keycuspidatum；explant；cal
5、lus；emodin；HPLC 目前药用植物细胞培养技术发展迅速,已从被研究的400多种植物细胞中分离出600多种次生代谢产物,其中有60多种在含量上超过或等于原植物[1],因此,利用细胞工程技术生产有用的次生代谢物质具有广阔的前景。虎杖(PolygonumcuspidatumSieb.etZucc.)是蓼科蓼属多年生灌木状草本植物虎杖的干燥根茎和根,性苦寒,归肝、肺、胆经,具有祛风利湿、祛痰止咳、清热解毒、活血化瘀之效。中医临床用于治疗湿热黄疸、肺热咳嗽、疮痈肿毒、关节痹痛、经闭经痛[2]。其根茎富含大黄素、虎杖苷
6、、白藜芦醇等多种活性成分。药理学研究表明,其主要活性成分大黄素具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、平喘等多种功效[3]。本实验通过对虎杖叶片、茎段、叶柄3种不同外植体诱导出愈伤组织,并采用HPLC法测定愈伤组织中大黄素的含量,研究不同外植体对愈伤组织中大黄素含量的影响,从而为利用细胞工程方法生产大黄素提供一定的实验依据。 1仪器与材料 Agilent1100series高效液相色谱仪；色谱柱：Diamonsil-C18(250mm×4.6mm,5μm)；Agilent色谱化学工作站。 大黄素对照品(中国药品生物制品检定所提
7、供,供含量测定用,批号756-9203)；虎杖愈伤组织为安徽省中药研究与开发重点实验室自行培养。甲醇为色谱纯；水为重蒸水；其余试剂均为分析纯。 2方法与结果 2.1愈伤组织培养[4] 选取健壮无病的虎杖植株,取其叶片、茎段、叶柄,用自来水冲洗干净。晾干后,在超净工作台内用75%酒精消毒30s,无菌水冲洗1次,然后用0.1%HgCl2溶液消毒8min,再用无菌水冲洗5次,每次5min,置无菌滤纸上晾干,切成0.5cm×0.5cm的小块,接种在MS＋6-BA0.2mg/L＋KT0.2mg/L＋2,4-D0.5mg/L
8、培养基中,温度(25±1)℃培养,30d后收获愈伤组织,60℃下烘干备用。 2.2色谱条件的选择及测定 2.2.1色谱条件[5] 色谱柱：Diamonsil-C18(250mm×4.6mm,5μm)；流动相：甲醇-0.1%磷酸(80∶20)；检测波长：254nm；流速：1.0mL/min；柱温：27℃；进样量：20μL。在上述条件下,
