缺氧肝细胞对肝星状细胞基质金属蛋白酶2表达及活

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1、缺氧肝细胞对肝星状细胞基质金属蛋白酶2表达及活【摘要】　　目的：探讨缺氧肝细胞对大鼠肝星状细胞基质金属蛋白酶2(MMP2)表达及其活性的影响。方法：缺氧培养肝细胞BRL3A(氧浓度5%)12h后取其培养上清作为条件培养基,培养肝星状细胞HSCT6,设6、12、24h3个时间点,RTPCR、酶图法分别检测HSCT6MMP2mRNA表达及其酶活性。以无血清DMEM培养肝星状细胞作为对照组。结果：随条件培养时间的延长,缺氧条件培养组HSCT6MMP2活性均升高(30.74±8.22、31.71±8.10、49.79

2、±13.61),且高于对照组(18.58±1.62、25.98±2.73、32.14±3.76),但扣除本底后缺氧条件培养基组HSCT6MMP2活性(12.99±2.05、14.01±2.00、29.44±3.62)均低于相应对照组,在6h和12h时间点差异有统计学意义(P6h=0.039,P12h=0.007),缺氧条件培养基组HSCT6MMP2mRNA表达量(0.44±0.07、3.66±1.10、4.29±0.99)高于相应对照组(0.61±0.07、2.50±0.27、0.52±0.16),差异具有统计学意义(P

3、6h=0.044,P24h=0.030)。结论：物理缺氧条件下,肝细胞分泌或释放了可溶性物质作用于肝星状细胞，使其MMP2表达上调,活性下降。肝细胞分泌或释放了何种物质尚待进一步研究。【关键词】基质金属蛋白酶2；缺氧；肝细胞；肝星状细胞；相互作用　　［Abstract］Objective：Toinvestigatetheeffectsofhypoxichepatocytesontheexpressionandtheactivityofmatrixmetalloproteinase2(MMP2)inrathepaticst

4、ellatecells.Methods：Hepatocytes(BRL3A)odifiedeaglemediumat37℃and5%CO2.MP2inthehypoxicconditionalgroupsatthreetimepoints(0.44±0.07,3.66±1.10,4.29±0.99)aysecretsomesubstancestopromoteMMP2expressionbutdepresstheactivityinhepaticstellatecells,andtheeffectcorrelatede.I

5、tisatrixmetalloproteinase2;hypoxia;hepatocyte;hepaticstellatecell；cellscrosstalk　　肝纤维化是许多慢性肝病共同的病理学表现,肝星状细胞(hepaticstellatecell,HSC)活化是肝纤维化过程中的关键环节。活化后的肝星状细胞分泌基质金属蛋白酶2(matrixmetalloproteinase,MMP2),而MMP2通过降解Ⅳ型胶原从而改变细胞外的基膜样基质而参与肝星状细胞活化和移行［1］。氧作为细胞赖以生存所必需的营养物质,其供应

6、异常显然将导致细胞功能紊乱。我们的前期研究［2-4］发现,物理性缺氧和化学性缺氧都会影响HSCMMP2表达及酶活性。在肝脏缺氧状态下,作为肝脏主体细胞,同时也是HSC的近邻——肝细胞,是否调节HSC表达MMP2有待阐明。　　1材料和方法　　1.1肝细胞缺氧处理和HSC缺氧条件培养　　大鼠肝细胞株BRL3A(购自中国科学院上海细胞库)和大鼠HCS株HSCT6(于美国Friedman实验室)分别以2×105ml-1细胞量接种于6孔塑料培养板中,用含10%优级胎牛血清的低糖DMEM培养液培养于37℃、体积分数为5%的CO2恒湿

7、培养箱中。肝细胞铺满孔底80%左右倾去完全培养基,PBS冲洗2遍后加入无血清低糖DMEM,将培养板放入自制缺氧盒内(容积1L),盒内通入氮气,测氧仪(上海雷磁新泾仪器有限公司,RSS5100型)监测氧浓度,当氧浓度达到5%时停止充氮气并密封缺氧盒。37℃、恒湿培养箱中培养12h后,取其离心后培养上清作为缺氧条件培养基培养HSC,分设6、12、24h3个时间点,各时间点设4复孔,将此4孔作为缺氧条件培养基组；以无血清DMEM培养HSC作为对照组,每个时间点设2复孔。在37℃、体积分数为5%的CO2恒湿培养箱中培养至设定时间收集上

8、清，离心去沉渣,用透析袋浓缩蛋白并定量后作明胶酶谱检查,细胞用Trizolreagent(购自Invitrogen公司)处理,提取总RNA,检测MMP2mRNA表达。　　1.2明胶酶谱法检测MMP2活性　　参照Carney等［5］的方法,用含1mg·ml-1