牛膝中对成骨样细胞umr106有促进增殖作用的活

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1、牛膝中对成骨样细胞UMR106有促进增殖作用的活【摘要】　　目的寻找牛膝中对成骨样细胞UMR106的增殖有显著促进作用的活性成分。方法运用薄层、色谱技术等方法进行分离，鉴定。结果分离出3个化合物，结晶Ⅰβ-谷甾醇、结晶Ⅱ胡萝卜苷、结晶Ⅲ蜕皮甾酮。结论牛膝的醋酸乙酯层用硅胶柱色谱、薄层色谱、反相高效液相色谱等分离手段进行化学分离，得到3种含量较大的化合物。【关键词】牛膝高效液相色谱β-谷甾醇胡萝卜苷蜕皮甾酮　　牛膝为苋科牛膝AchyrenthesbidentataBI的干燥根，主产于河南省，也称怀牛膝，具补肝肾，强筋骨的功能。主治腰膝酸痛，下肢萎软。药理学研究表

2、明：牛膝具有保肝、降酶、镇痛、抗炎、增强免疫力及抗衰老作用。其化学成分主要为多糖，齐墩果酸类三萜皂苷和植物甾酮类。根据中医理论，对30种中药提取物进行活性筛选，发现牛膝的甲醇提取物对破骨细胞具有较强抑制作用。进一步研究证实：牛膝正丁醇可溶部分为其活性成分。为了寻找牛膝中显著促进骨样细胞UMR106增殖的活性成分，对牛膝的甲醇提取物的正丁醇可溶部分的化学成分进行研究，分离得到3个已知化合物。　　1材料与方法　　1.1仪器、试剂及药品　　1.1.1仪器　　JJascoPU-980高效液相色谱输液泵（日本分光公司），JascoUV-975紫外-可见检测器(日本分光公

3、司)；CKChrom色谱工作站（ScientificSystemInc.），CX-250超声波清洗器（北京医疗设备二厂），1H-NMRBrukerARX-300（300MHz）核磁共振仪。　　1.1.2试剂　　乙腈（色谱纯），天津四友生物医学技术有限公司提供；硅胶，青岛海洋化学试剂厂提供。　　1.1.3药材　　牛膝购自辽宁省沈阳市中药材公司，经本校药用植物教研室孙启时教授鉴定为AchyranthesbidentataBI．之干燥根对照品β-谷甾醇、胡萝卜苷、蜕皮甾酮对照品由本校天然药化研究室李铣教授提供（纯度均>90%）。　　1.2药物提取及分离　　1.

4、2.1牛膝药材醋酸乙酯层的提取　　取牛膝药材细粉1.5kg，放入圆顶烧瓶中，用75%乙醇加热回流提取3次，合并滤液，进一步减压回收溶液得到乙醇提取浸膏。浸膏用水溶液，得到水混悬液。混悬液用石油醚萃取，萃取后保留石油醚层，放入棕色瓶中，混悬液用氯仿萃取，得到氯仿层。混悬液用正丁醇和醋酸乙酯萃取，分别得到了醋酸乙酯和正丁醇层及水层。顺利完成了提取工作。　　1.2.2牛膝醋酸乙酯层的分离　　取牛膝醋酸乙酯层浸膏适量，用石油醚-丙酮进行梯度硅胶柱层析，溶剂梯度变化顺序为：石油醚-丙酮（200∶1）、石油醚-丙酮（100∶1）、石油醚-丙酮（50∶1）、石油醚-丙酮（2

5、0∶1）、石油醚-丙酮（10∶1）、石油醚-丙酮（5∶1）、石油醚-丙酮（3∶1）、石油醚-丙酮（2∶1）、石油醚-丙酮（1∶1）、丙酮，每个溶剂梯度用5个层析硅胶柱的保留体积洗脱,每250ml为一馏分，各馏分回收溶剂后，用硅胶GF254薄层板检验各馏分成分，合并主要成分相同的馏分［1］。　　当洗脱溶剂为石油醚-丙酮（10∶1）时，收集馏分60-66，用硅胶制备薄层进行制备，以石油醚-丙酮（5∶1）为展开系统，氯仿-甲醇重结晶得化合物Ⅰ。　　当洗脱溶剂为石油醚-丙酮（2∶1）时，收集馏分192-199，经硅胶制备薄层进行制备，以氯仿-甲醇-水（65∶35∶10

6、）为展开系统，氯仿-甲醇（1∶1）重结晶得化合物Ⅱ。　　当洗脱溶剂为丙酮时，收集馏分202-214，经硅胶制备薄层进行制备，以醋酸乙酯-甲醇（4∶1）为展开系统，甲醇重结晶，反相高效液相色谱制备，以水-乙腈-四氢呋喃（86∶11∶3）为流动相，得化合物Ⅲ。　　1.3含药细胞培养液的配制取从牛膝醇提物的醋酸乙酯层浸膏中分离得到的每种化合物约1mg溶于1mlDMSO中，配成1mg/ml的储备液，进行细胞的增殖检测实验时，用无血清MEM依次稀释成1.0×10－2，1.0×10－3，1.0×10－4，1.0×10－5，1.0×10－6，1.0×10－7mg/ml6个浓

7、度。　　2结果　　牛膝中分离得到的3种化合物的鉴定：化合物Ⅰ：白色针晶，mp139～142℃，Liebermann-Burchard反应阳性，用以下面3种溶剂系统为展开剂进行薄层色谱时：①石油醚-丙酮（5∶1）；②环己烷-醋酸乙酯（5∶2）；③氯仿-石油醚-醋酸乙酯（8∶6∶1），和对照品β-谷甾醇Rf相同，和对照品混合后熔点不降低。故鉴定为β-谷甾醇(β-sitosterol)。　　化合物Ⅱ：白色粉末，mp303～305℃，Libermann-Burchard和Molish反应均为阳性，用以下面3种溶剂系统为展开剂进行薄层色谱时：①甲醇-醋酸乙酯-冰乙酸（6

8、∶4∶2）；②醋酸乙酯-甲醇（4∶1）