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1、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis【摘要】目的分离纯化枯草芽孢杆菌(BacillussubtilisZY-1)溶栓酶,探讨该酶的理化性质。方法枯草芽孢杆菌培养,利用(NH4)2SO4沉淀、SephadexG-100柱层析对该酶发酵液进行分离纯化,利用四肽底物Sue-Ala-Ala-Pro-Phe-PNA作为底物,研究酶的理化性质。结果经发酵并纯化后获得的酶液其比活高达26400U/mg,酶反应最适温度45℃,最适pH8.0,且具有较好的热稳定性。结论枯草芽孢杆菌溶栓酶具有溶血栓作用。【关键词】芽孢杆
2、菌,枯草;纤溶酶ABSTRACT:ObjectivePurificationofafibrinolyticenzymeproducedfromBacillussubtilisZY-1andinvestigationofitsactivityandcharacterization.MethodsAhighfibrinolyticenzymeatography,andcharacterizationaticactivitiesindifferentconditions.ResultsThespecificactiv
3、ityofenzymeg,anditsoptimaltemperatureandpHehadfinethermalheatstability.ConclusionTheenzymehadpotentialmercialvalue. KEYgSO4。在发酵培养基100mL中接种液体菌种6mL,37℃,摇床转速为180r/min,发酵72h。 1.2方法 1.2.1溶栓酶分离纯化 取含溶栓酶的发酵液,经9000r/min离心、30%~70%(NH4)2SO4分步沉淀,9000r/min再离心,沉淀用0.02
4、mol/LTris-HCl(pH7.2)缓冲液溶解后透析浓缩得粗酶液[9]。SephadexG-100柱(上海华美实验仪器厂)层析分离纯化溶栓酶:按常规方法处理的SephadexG-100装入层析柱(1.5cm×45cm),用0.02mol/LHCl-Tris(pH7.2)缓冲液平衡。将已浓缩的粗酶液1mL加入柱中,以相同缓冲液1mL/min流速洗脱,以每1mL/min为一管分部收集,用四肽底物法检测洗脱液,收集含有活性的组分。 1.2.2SDS-PAGE分析 制备12%分离胶,5%浓缩胶,上样量20μL,
5、30mA稳流电泳(DYY-11型电泳仪,北京市六一仪器厂),用考马斯亮蓝R250染色[10]。 1.2.3溶栓酶活性测定 在四肽底物Sue-Ala-Ala-Pro-Phe-PNA溶液中加入豆豉溶栓酶酶液1μL(稀释10倍),37℃中孵育1min,测定单位时间内405nm处光吸收的变化。酶的活性单位定义为:1min水解该四肽底物生成1μmol对硝基苯胺的豆豉溶栓酶量为1U。 1.2.4溶栓酶性质检测 利用四肽Sue-Ala-Ala-Pro-Phe-PNA作为底物,研究温度、pH值、金属离子、有机溶剂对该酶
6、的影响。 1.2.4.1热稳定性 取酶液1μL和1mmol/L底物49μL溶于0.02mmol/LTris-HCl(pH8.0)缓冲液50μL,在不同温度(25,35,45,55,65,75,85℃)下反应1min测定酶活性。 1.2.4.2pH值 取酶液1μL和1mmol/L底物49μL分别溶于不同pH的缓冲液50μL(pH4.0,5.0为0.05mol/L醋酸缓冲液,pH6.0,7.0,7.5,8.0为0.05mol/L磷酸缓冲液,pH9.0,10.0为0.05mol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液,pH
7、11.0,12.0为0.05mol/L磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液)于37℃反应1min,测定酶活性。 1.2.4.3金属离子 取酶液1μL和1mmol/LNaCl、KCl、CaCl2、MgCl2等溶液10μL溶于0.02mmol/LTris-HCl(pH8.0)缓冲液40μL,于37℃静置30min,分别加入1mmol/L底物49μL,于37℃反应1min,测定酶活性。 1.2.4.4有机溶剂 以甲醇、乙醇、异丙醇3种不同有机溶剂为效应物,测定酶活性。 1.2.5溶栓酶体外对血凝 奶牛体表采血。取4
8、支装有血液1mL的试管分别加入等体积的稀释倍数不同的酶液,将其放入在37℃水浴锅中保温10min后观察。 2结果 2.1枯草杆菌溶栓酶的纯化 溶栓酶在第2个洗脱峰(图1)。纯化结果见表1。纯化倍数3.41,回收率10.29%。表1溶栓酶的纯化(略) 2.2溶栓酶的SDS-PAGE 溶栓酶经纯化步骤后得到纯酶,其相对分子质量为32kD(图2)。 2.3溶栓酶的理化性质 2.