宫颈癌细胞中辅酶ⅱ依赖性视黄醇脱氢-还原酶及其选

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1、宫颈癌细胞中辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶及其选【摘要】目的：构建宫颈癌细胞中辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶(NRDR)及选择性剪接亚型NRDRB1真核表达载体，并转染HeLa细胞表达融合蛋白和native蛋白。方法：分别以pDONR_NRDR、pDONR_NRDRB1载体为模板，用PCR方法扩增两端带有酶切位点的NRDR及NRDRB1编码区序列，酶切后连接到pCDNA3、pCMV_Myc真核表达载体上，经酶切、测序鉴定后，转染HeLa细胞16?h，yc标签的蛋白和不带标签的native蛋白；质谱分析结果进

2、一步证实所表达的蛋白为NRDR和NRDRB1。结论：获得了在真核细胞中表达的NRDR、NRDRB1蛋白，为进一步研究其功能提供了实验材料。【关键词】辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶选择性剪接宫颈癌真核表达［Abstract］Objective：ToconstructtheexpressionplasmidsofNADP(H)_dependentretinoldehydrogenase/reductase(NRDR)andNRDRB1，andtoexpresstheproteinsinmammaliancell

3、s.Methods：ThecodingregionsofNRDRandNRDRB1plifiedfrompDONRvectors.ThefragmentsofNRDRandNRDRB1ammalianexpressionvectorpCDNA3andpCMV_Mycafterrestrictionenzyme.HeLacellsids，andthetargetproteinsidsofpCDNA3_NRDR，pCDNA3_NRDRB1，pCMV_Myc_NRDRandpCMV_Myc_NRDRB1eands

4、equencing.Aftertransfection16hours，thetargetproteinsassspectrometry.Conclusion：TherebinantNRDRandNRDRB1fromhumancervicalcarcinomacellscanbeexpressedinmammliancells.［KeyI1640培养基中。含NRDR、NRDRB1编码区的pDONR载体由本室构建并保存。高保真Taq酶pfu，pCDNA3和pCMV_Myc载体(Invitrogen公司，美国)，

5、限制性内切酶BamHⅠ、XhoⅠ、BglⅡ、SalⅠ、NotⅠ以及T4DNA连接酶(NEB公司，德国)，V_Myc载体设计的引物序列，上游引物：5′_GATAGATCTGGATGGCCAGCTCCGGGATG_3′，下游引物：5′_AAGGCGGCCGCTCAGAGGCGGGACGGGGTT_3′，引物由广州Invitrogen公司合成。AGATCT、GTCGAC、GCGGCCGC分别为BglⅡ、SalⅠ和NotⅠ的酶切位点，5′端的3个碱基为保护序列。13真核表达载体的构建及转染分别以pDONR_NRD

6、R、pDONR_NRDRB1为模板，以上述带有酶切位点的引物进行PCR扩增。PCR产物分别经BglⅡ、SalⅠ和BglⅡ、NotⅠ酶切，胶回收纯化酶切片断。pCDNA3、pCMV_Myc载体分别用BamHⅠ、XhoⅠ和BglⅡ、NotⅠ进行酶切，纯化载体酶切产物与NRDR、NRDRB1酶切片断连接，转化感受态菌(DH5α)。挑取单菌落进行PCR鉴定，并提取质粒测序。对于测序鉴定的单菌落细菌进行扩大培养，用高纯度质粒大提试剂盒提取质粒，SuperFect转染试剂盒转染对数生长期的HeLa细胞。14重组蛋白检

7、测收集转染16?h的HeLa细胞，提取细胞总蛋白，经质量分数12%的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS_PAGE)，将蛋白转移至nitrocellulose膜，质量分数1%的BSA室温封闭1?h。一抗(已纯化的NRDR抗兔多克隆抗体，本室制备)孵育1?h，1×PBS洗3次，每次5?min；二抗采用horseradishperoxidase标记的goatanti_rabbitIgG(1∶3000，Pierce公司，美国)孵育1?h，用PierceECLkit进行化学发光，检测NRDR、NRDRB1蛋白表达。15质谱

8、分析将目的蛋白从SDS_PAGE胶上切下，经胰蛋白酶消化处理后，在质谱仪上对目的蛋白进行肽指纹图谱分析。第2期宋旭红等.宫颈癌细胞中辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶及其选择性剪接亚型真核表达载体的构建和表达2结果21NRDR、NRDRB1克隆至真核表达载体将扩增的NRDR、NRDRB1片断与真核表达载体酶切，连接后转化DH5α，挑取单菌落用PCR方法鉴定(图1)，提取质粒后进行酶切鉴定(图2)，测序结果证实NRD