ox42和fos蛋白在海人酸致癫大鼠前脑中早期

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1、OX42和Fos蛋白在海人酸致癫大鼠前脑中早期【摘要】目的：研究大鼠在海人酸(KA)导致癫痫发作早期前脑内小胶质细胞的变化及其与神经元的关系.方法：应用免疫组织化学法单标分别显示前脑内OX42和Fos蛋白表达的时间规律，并用免疫组织化学双重标记显示OX42和Fos阳性细胞的相互关系.结果：在KA致大鼠癫痫发作早期（从15min到360min），前脑的小胶质细胞OX42表达阳性，随着存活时间的变化，OX42的阳性反应经历逐渐升高又降低的过程；反应强弱：120min组>360min组>60min组>30m

2、in组>15min组.Fos蛋白在神经元和小胶质细胞中均表达阳性，也呈现逐渐升高又降低的变化,但Fos阳性小胶质细胞出现高峰的时间早于Fos阳性神经元,各组间Fos阳性神经元数量差异均有统计学意义（P<0.01）.OX42阳性小胶质细胞和Fos阳性神经元在前脑主要分布于大脑皮层、海马、杏仁核等部位，两者的分布特征基本一致.结论：小胶质细胞可能和神经元一起参与了KA所致癫痫发作早期的变化.【关键词】小神经胶质细胞神经元OX42Fos癫痫大鼠　0引言　　癫痫是一组慢性脑病综合征，其发病与神经免疫内分泌网络的调节失

3、衡有关［1］.既往有关癫痫的研究多围绕神经元和星形胶质细胞展开［2］，而对小胶质细胞的相关研究以及有关癫痫发作后短时间内小胶质细胞有无变化的研究尚少见报道.本实验观察了小胶质细胞在癫痫发作后短时间内的变化，以探讨癫痫发作早期小胶质细胞的活化及其与神经元的关系和小胶质细胞在癫痫发作时可能的作用.　　1材料和方法　　1.1材料SD成年雄性大鼠35只，体质量200~250g（第四军医大学实验动物中心提供），将动物置于20℃、安静的环境中饲养48h.小鼠抗OX42抗体（产品编号：CBL1512P），兔抗Fos抗体（产品编号：MAB12

4、83）（美国SantaCruz公司）；生物素标记山羊抗小鼠IgG（产品编号：C0252），生物素标记的山羊抗兔IgG（产品编号：C0252），生物素卵白素HRP复合物（ABC，产品编号：C1785）（美国Sigma公司）；BX60型显微镜（日本奥林巴斯公司）；DF300图像采集数码摄像头（德国莱卡公司）.　　1.2方法　　1.2.1实验分组将大鼠随机分为对照组（n=5）和癫痫发作后15，30，60，120，360min5个实验组（n=6）.　　1.2.2组织材料的处理大鼠按体质量6mg/kg腹腔注射5g/L的海人酸（ka

5、nicacid，KA）并观察其行为变化，凡出现凝视、湿狗样抖动、节奏性咀嚼、点头、肢体阵挛、阵发性旋转、跌倒等癫痫发作的表现，即为模型制作成功.各实验组用过量10g/L戊巴比妥钠（>40mg/kg，i.p.）麻醉，迅速开胸经左心室至升主动脉插管，先以100mL生理盐水洗去血液，随后用4℃含40g/L多聚甲醛的0.1mol/L磷酸盐缓冲液（PB,pH7.4）先快后慢灌流固定2h，然后取脑置于300g/L的蔗糖中（4℃）直至组织沉底.冰冻切片机切制连续冠状切片，片厚30μm，切片分为三套，置于0.01mol/LPBS中存放.　

6、　1.2.3免疫组织化学标记　　1.2.3.1免疫组织化学单重标记取2套切片在0.01mol/LPBS中漂洗后，入含3g/LTritonX100的0.01mol/LPBS中浸泡30min，然后依次进行：①小鼠抗OX42抗体稀释液（1∶3000）或兔抗Fos抗体稀释液（1∶3000）孵育24h；②生物素标记的山羊抗小鼠IgG（1∶500）或生物素标记的山羊抗兔IgG（1∶500）孵育2~4h；③生物素卵白素HRP复合物（ABC，1∶500）浸泡2~4h.然后用葡萄糖氧化酶DAB硫酸镍铵法染色，OX42和Fos产物均呈

7、蓝色，OX42以小胶质细胞胞质出现蓝色颗粒判定为阳性，Fos以神经元和小胶质细胞的细胞核出现蓝色颗粒判定为阳性.以上每一步骤之后均用0.01mol/LPBS液充分漂洗3次，每次10min.显色后切片经漂洗后裱片、晾干、脱水、透明，封固后显微镜观察并采集图像.　　1.2.3.2免疫组织化学双重标记另取1套切片单重标记抗Fos显色后，再进行抗OX42的第二重染色.①小鼠抗OX42抗体稀释液（1∶3000）室温孵育24h；②生物素标记的山羊抗小鼠IgG（1∶500）室温孵育2~4h；③生物素卵白素HRP复合物（ABC，1∶5

8、00）室温浸泡2~4h.DABH2O2溶液中进行棕色反应，OX42阳性产物呈棕色结果判定为阳性.结束两次染色的切片经漂洗后裱片、晾干、脱水、透明，封固后在光镜下观察并采集图象.OX42阳性反应强弱，+/-：表示弱阳性或无反应；+：表示弱阳性；：表示阳性；