dcr3在结肠癌患者外周血及癌组织中表达水平的检测

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1、DcR3在结肠癌患者外周血及癌组织中表达水平的检测1材料和方法1.1标本2004-05/2005-12在西安交通大学医学院第一附属医院就诊,经病理学确诊的结肠癌患者44例,男25例,女19例,年龄27~78岁,平均52岁。经病理学确诊的其他消化道肿瘤患者20例,男12例,女8例,年龄34~72岁,平均48岁。健康对照组30例,男18例,女12例,年龄28~65岁,平均46岁。癌组织石蜡包埋组织26例。其中结肠癌患者17例,其他消化道肿瘤患者9例。1.2主要仪器和试剂TMSF倒置显微镜为日本尼康产品;7700型荧光定量PCR仪为美国PE公司产品

2、;TannonGIS型全自动凝胶成像分析系统购自上海Tannon公司;细胞总RNATRIzol提取液及DNTPs购自Promega公司;cDNA第一链合成试剂盒为美国Fermentas产品;TaqDNA聚合酶购自晶美生物公司;引物由大连宝生物生物工程公司合成;DcR3单克隆抗体(mAb)由汤南博士惠赠;S100蛋白和SP试剂盒均购自北京鼎国生物公司。1.3方法1.3.1外周血单核细胞分离每个实验对象抽取5mL静脉血,肝素抗凝,用常规密度梯度离心法分离外周血单个核细胞,用预冷的生理盐水洗3遍后,迅速放入-70℃冰箱冻存备用。1.3.2RTPC

3、R检测DcR3mRNA的表达水平用细胞总RNATRIzol提取液提取总RNA,PCR扩增,PCR产物经15g/L的普通琼脂糖凝胶电泳后,溴化乙啶染色,通过TannonGIS影像分析仪进行DNA条带和强度分析,把DcR3和βactin的比值作为DcR3基因的相对表达水平进行比较。1.3.3免疫组化检测DcR3蛋白的表达水平免疫组化染色SP法,按说明书进行操作。1.3.4统计学分析DcR3基因相对表达水平数据以x±s表示,采用组间配对t检验。2结果2.1DcR3mRNA水平的检测结果显示,结肠癌患者、其他消化道肿瘤患者和健康人外周血单核细胞中均检

4、测到DcR3基因的表达。PCR产物电泳后在144bp大小位置均见有一清亮条带,与预计的DcR3基因片段大小一致,同时在660bp大小位置也显示有清亮条带,此为内参照基因βactin片段产物(图1)。DNA条带和强度分析显示,结肠癌患者外周血单核细胞DcR3基因呈过度表达,其相对表达水平为0.421±0.075,而其他消化道肿瘤患者和健康人外周血单核细胞中DcR3基因有低水平的表达,其相对表达水平分别为0.248±0.076和0.235±0.074(图2)。结肠癌患者与其他消化道肿瘤患者和健康人DcR3基因表达水平相比有差异(P<0.05

5、),而其他消化道肿瘤患者和健康人DcR3基因表达水平相比则无统计学意义(P>0.05)。2.2DcR3蛋白表达水平的检测DcR3定位于细胞质和癌巢周围间质细胞,以至少有20%的肿瘤细胞内出现棕黄色颗粒者为阳性细胞,400倍光镜下随机选取5个视野计数,判断DcR3阳性表达率。结果显示,17例结肠癌组织中有13例(76.47%)阳性表达,而9例其他消化道肿瘤组织中仅有1例(11.11%)阳性表达,正常结肠组织均无表达(图3)。结肠癌患者与其他消化道肿瘤患者和健康人DcR3蛋白表达水平相比有统计学意义(P<0.05),而其他消化道肿瘤患者

6、和健康人DcR3蛋白表达水平相比则无统计学意义(P>0.05)。3讨论本研究对经病理学确诊的结肠癌患者44例、其他消化道肿瘤患者20例、健康对照组30例,采用RTPCR法检测了外周血中的DcR3mRNA表达水平;对经病理学确诊的结肠癌患者17例、其他消化道肿瘤患者9例和5例正常结肠组织做免疫组化,检测了DcR3蛋白表达水平。发现结肠癌患者血中DcR3mRNA及癌组织中DcR3蛋白表达明显高于正常人和其他消化道肿瘤患者,说明结肠癌发生时DcR3mRNA和蛋白表达异常升高,可以推断DcR3异常表达与结肠癌有一定的关系。有研究[1,2]表明许

7、多人类恶性肿瘤显示DcR3无论在基因水平还是在蛋白水平均出现过度表达,而且这种过度表达仅仅出现在肿瘤组织中,临近的正常组织则几乎测不出DcR3的表达,DcR3表达状态与肿瘤分化程度、淋巴结转移及TNM分期显著正相关。本研究结果与其研究结果相符。目前,尽管结肠癌病因及发病机制尚未完全明了,但是认为其发病机制主要与免疫逃逸有关[3]。有研究表明其免疫逃逸主要是因为由Fas/FasL通路介导的细胞凋亡减少所致[4]。Fas抗原((APO1/CD95)与Fas配体(FasL)组成的Fas系统,在将凋亡信号转导入细胞内发挥重要作用。大多数良性肿瘤Fas

8、表达类似正常组织,而恶性肿瘤的Fas表达明显下降或丢失,推测恶性肿瘤的发生发展可能与Fas丢失,逃避通过Fas/FasL系统的清除作用有关。对比正常结

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