dcr3在结肠癌患者外周血及癌组织中表达水平的检测

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1、DcR3在结肠癌患者外周血及癌组织中表达水平的检测作者：胜利,安利峰,史霖,范桂香,袁育康【关键词】DcR3;结肠癌;表达诱骗受体3(decoyreceptor3,DcR3)是新近发现的一种可溶性的肿瘤坏死因子受体（tumournecrosisfactorreceptor,TNFR）家族成员［1］。研究表明它在某些肿瘤、自身免疫病等疾病中高度表达,其蛋白的表达和基因的扩增与人类多种恶性肿瘤的发生、发展以及肿瘤的免疫逃逸密切相关［2］。故我们研究DcR3在结肠癌患者外周血及癌组织中的表达,阐明其与结肠癌的相关性。1材料和方法1.1标本来源2004

2、-05/2005-12在西安交通大学医学院第一附属医院就诊,经病理学确诊的结肠癌患者44例,男25例,女19例,年龄27～78岁,平均52岁。经病理学确诊的其他消化道肿瘤患者20例,男12例,女8例,年龄34～72岁,平均48岁。健康对照组30例,男18例,女12例,年龄28～65岁,平均46岁。癌组织石蜡包埋组织26例。其中结肠癌患者17例,其他消化道肿瘤患者9例。71.2主要仪器和试剂TMSF倒置显微镜为日本尼康产品;7700型荧光定量PCR仪为美国PE公司产品;TannonGIS型全自动凝胶成像分析系统购自上海Tannon公司;细胞总R

3、NATRIzol提取液及DNTPs购自Promega公司;cDNA第一链合成试剂盒为美国Fermentas产品;TaqDNA聚合酶购自晶美生物公司;引物由大连宝生物生物工程公司合成;DcR3单克隆抗体（mAb）由汤南博士惠赠;S100蛋白和SP试剂盒均购自北京鼎国生物公司。1.3方法1.3.1外周血单核细胞分离每个实验对象抽取5mL静脉血,肝素抗凝,用常规密度梯度离心法分离外周血单个核细胞,用预冷的生理盐水洗3遍后,迅速放入-70℃冰箱冻存备用。1.3.2RTPCR检测DcR3mRNA的表达水平用细胞总RNATRIzol提取液提取总RNA,

4、PCR扩增,PCR产物经15g/L的普通琼脂糖凝胶电泳后,溴化乙啶染色,通过TannonGIS影像分析仪进行DNA条带和强度分析,把DcR3和βactin的比值作为DcR3基因的相对表达水平进行比较。1.3.3免疫组化检测DcR3蛋白的表达水平免疫组化染色SP法,7按说明书进行操作。1.3.4统计学分析DcR3基因相对表达水平数据以x±s表示,采用组间配对t检验。2结果2.1DcR3mRNA水平的检测结果显示,结肠癌患者、其他消化道肿瘤患者和健康人外周血单核细胞中均检测到DcR3基因的表达。PCR产物电泳后在144bp大小位置均见有一清亮条带

5、,与预计的DcR3基因片段大小一致,同时在660bp大小位置也显示有清亮条带,此为内参照基因βactin片段产物（图1）。DNA条带和强度分析显示,结肠癌患者外周血单核细胞DcR3基因呈过度表达,其相对表达水平为0.421±0.075,而其他消化道肿瘤患者和健康人外周血单核细胞中DcR3基因有低水平的表达,其相对表达水平分别为0.248±0.076和0.235±0.074（图2）。结肠癌患者与其他消化道肿瘤患者和健康人DcR3基因表达水平相比有差异(P<0.05),而其他消化道肿瘤患者和健康人DcR3基因表达水平相比则无统计学意义(P&

6、gt;0.05)。2.2DcR3蛋白表达水平的检测DcR3定位于细胞质和癌巢周围间质细胞,以至少有20%的肿瘤细胞内出现棕黄色颗粒者为阳性细胞,400倍光镜下随机选取5个视野计数,7判断DcR3阳性表达率。结果显示,17例结肠癌组织中有13例(76.47%)阳性表达,而9例其他消化道肿瘤组织中仅有1例(11.11%)阳性表达,正常结肠组织均无表达（图3）。结肠癌患者与其他消化道肿瘤患者和健康人DcR3蛋白表达水平相比有统计学意义(P<0.05),而其他消化道肿瘤患者和健康人DcR3蛋白表达水平相比则无统计学意义(P>0.05)。3讨

7、论本研究对经病理学确诊的结肠癌患者44例、其他消化道肿瘤患者20例、健康对照组30例,采用RTPCR法检测了外周血中的DcR3mRNA表达水平;对经病理学确诊的结肠癌患者17例、其他消化道肿瘤患者9例和5例正常结肠组织做免疫组化,检测了DcR3蛋白表达水平。发现结肠癌患者血中DcR3mRNA及癌组织中DcR3蛋白表达明显高于正常人和其他消化道肿瘤患者,说明结肠癌发生时DcR3mRNA和蛋白表达异常升高,可以推断DcR3异常表达与结肠癌有一定的关系。有研究［1,2］表明许多人类恶性肿瘤显示DcR3无论在基因水平还是在蛋白水平均出现过度表达,而且

8、这种过度表达仅仅出现在肿瘤组织中,临近的正常组织则几乎测不出DcR3的表达,DcR3表达状态与肿瘤分化程度、淋巴结转移及TNM分期显著正相关。本研究结