产淀粉酶的活性芽胞杆菌的分离、鉴定与育种.doc

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1、题目产淀粉酶的活性芽胞杆菌的分离、鉴定与育种摘要首先通过淀粉培养基从土壤中筛选出产淀粉酶的活性菌株，对菌株初步鉴定后进行微波诱变，筛选出产量高、性状优良的正突变菌株，并用正交实验的方法，从发酵培养基三个主要成分（玉米粉、黄豆饼粉、酵母粉）对产酶条件进行优化，实验最后利用多相分类的方法对筛选出的正突变菌株做了菌种鉴定，初步确定为短芽孢杆菌。引言淀粉酶是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。淀粉酶种类繁多,特点各异,在造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂等多种领域具有广阔的用途[1]。

2、现在淀粉酶主要来源于植物和微生物[2]并通过发酵完成生产，因此筛选出高产、稳定的淀粉酶产生菌是淀粉酶生产的头等大事[3]。本文试图从土壤中分离出产淀粉酶的芽孢杆菌，通过诱变育种及发酵条件优化来得到高产、稳定的淀粉酶产生菌株。一、研究方法1、实验材料：河北大学生命科学学院院前的土壤2、仪器设备：高压蒸汽灭菌锅、培养皿、培养基分装器、PH试纸、移液管、吸耳球、玻璃棒、量筒、三角刮、试管、试管架、酒精灯、电子天平、显微镜、三角烧瓶、洗瓶、接种针、接种环、双层瓶、擦镜纸、德汉氏小管、直尺、记号笔等。诱变箱：微波炉（E30E-3）离心机、721分光光度计：3、培养基和试剂

3、（1）培养基：淀粉培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、种子培养基[4、7]、出发培养基[4、7]、糖发酵培养基、明胶培养基、柠檬酸盐培养基、醋酸铅培养基、蛋白胨液体培养基（吲哚实验）、葡萄糖蛋白胨培养基（V.P.、M．R实验）、硝酸盐液体培养基、酪素培养基（2）试剂：碘液、孔雀绿染液、番红染液、乙醚、吲哚试剂、KOH、α-耐酚、甲基红、格里斯氏试剂、锌粉、3%H2O2、柠檬酸缓冲液、1%淀粉溶液、3,5-二硝基水杨酸（注：所用药品均为分析纯）。4、实验方法（1）细菌的分离与初步鉴定：将土壤系列稀释，把10-4、10-5、10-6分别涂布到淀粉培养基上，37℃倒置、过夜培

4、养，影印，将碘液加到淀粉平板上，记录出现水解圈的单菌落的H/C值[5]。将出现水解圈的菌落进行芽孢染色，显微观察菌种形态。保菌供下次实验用。（2）微波诱变[6]：将新鲜斜面上的菌种转接到液体的牛肉膏蛋白胨培养基中37℃下培养18-24h。将菌液离心、洗涤、稀释，在一定功率下分别诱变30s、60s、90s，稀释菌液并涂布到淀粉培养基平板上，37℃下过夜培养，分别测水解圈的H/C值，将正突变的菌种保存到斜面培养基上。（3）高产菌株发酵条件的优化[7]：通过正交试验对高产菌的发酵条件进行优化，建立高产菌株的最佳摇瓶发酵条件。将诱变得到的菌种接种到种子培养基瓶中培养12

5、-16h，之后，将种子瓶中的菌液以5%的接种量分别接种到出发培养基和优化培养基中，发酵18-24h后，用DNS法测酶活及制麦芽糖-OD标准曲线，确定最佳发酵条件。水平实验因素玉米粉A（g/L）黄豆饼粉B（g/L）酵母粉C（g/L）1818229224311235表1实验因素与水平试验号因素ABCD111112122231333421235223162312731328321393321表2不同处理的试验结果(4)活性菌株的鉴定[8]：利用多相分类的方法对所分离的菌株进行鉴定：形态鉴定：个体和群体形态鉴定生理生化反应：将诱变得到的正突变菌株进行以下反应：糖发酵实验

6、、甲基红实验、V.P实验、柠檬酸盐利用实验、吲哚实验、H2S实验、硝酸盐还原实验、明胶水解实验、过氧化氢酶实验、酪素水解实验、耐盐实验。（注：各实验所用培养基及试剂见附录）一、研究结果和分析1、显微镜观察芽孢染色，可知分离得到的为芽孢杆菌。2、H/C值（1）在分离芽孢杆菌时，影印之后水解圈粘连在一起，无法准确测得H/C值。分析：可能是所采土样中产淀粉酶的芽孢杆菌含量较多，涂平板之前稀释倍数不够导致单菌落过于密集，水解圈粘连。（2）紫外诱变后的平板影印：单菌落透明圈直径/mm(H)菌落直径/mm(C)H/C①4.83.01.6②6.43.51.8③15.84.83

7、.3④16.04.93.3⑤11.84.52.6⑥9.84.02.5⑦17.05.03.4表3透明圈直径（H）和菌落直径（C）及比值分析：通过结果，可看出经过紫外诱变后，有的菌株产酶活能力有所提高，有的减小，筛选产酶活能力最高的菌株，保存供后续试验使用。3、正交试验优化发酵条件（1）、麦芽糖标准曲线分析：标准曲线的精确度不高，原因主要有三点：①、最后所测三个OD值都超过了0.7，显著偏大，可能是稀释倍数不够所致；①、本实验所用的分光光度计使用年限已久，难免会造成测量结果有误差；②、由于操作失误，忘记每个试管做平行测量，造成结果不精确。（2）、酶活力的测定试验号对

8、照出发123456789