col1a1、col3a1在发育性髋脱位患儿圆韧带的表达

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1、COL1a1、COL3a1在发育性髋脱位患儿圆韧带的表达：王恩波，赵群，李连永，史立伟，李建军，高红【摘要】［目的］探求发育性髋脱位(developmentaldislocationofthehip,DDH)患儿与正常儿圆韧带中Ⅰ、Ⅲ型胶原在mRNA及蛋白水平的表达差异。［方法］选取性别相同年龄相近的6对发育性髋脱位患者及正常儿配对比较。采用半定量RT-PCR及ethod］Therealcontrolgroupesexandage.SemiquantityRT-PCRmethodentumteresatmRNAlevel.gSO44μl；10mmol/LdN

2、TPs1μl；22u／μlAMV1μl；50μmol/Lligo-dT1μl；40u／μIRNaseinhibitor0.5μl；ddH200.5μl。混匀后置于下列温度反应：65℃1min，30℃5min，于30min匀速升温至65℃，65℃30min，98℃5min，5℃5min。1.2.3聚合酶链反应在25μl反应体系中，分别加入：DNA；ddH20；PCRbuffer(10×)；dNTPs(各2.5mmol/L)；TaqDNA聚合酶(5u／μl)；待测指标的上游引物和下游引物(上海英俊生物公司)；引物终浓度为5～20pmol/L。各指标及内参GAPD

3、H引物的序列、扩增条件见表1。表1PCR引物序列及产物长度引物名称核苷酸序列产物长度(bp)Genebank循环条件COLlal上游5’-AACATAATCCGCAGTGGCCT-3’下游5’-CTCCTGTTGCGTTGCTCCTT-3’509BC03653194℃3min，94℃30s65℃40s，72℃1min35个循环后，72℃7minCOL3al上游5’-CCCAGAACATCACATATCAC-3’下游5’-CAAGAGGAACACATATGGAG-3’366NM00009094℃3min，90℃30s58℃40s，72℃1min35个循环后，7

4、2℃7minGAPDH上游5’-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3’下游5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’307XR01831795℃3min，95℃30s60℃30s，72℃1min40个循环后，72℃7min1.2.4PCR产物电泳及检测取反应产物10μl在含有溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下检查特异条带，1Dkodar成像系统成像，应用Scionimage软件对条带灰度进行半定量分析。1.3ol/L乙酸,pH2.5)以10%胃蛋白酶消化22h。-4℃19000r/min离心1h，2mol/LNaCl加入上清，-4℃19

5、000r/min离心1h，上清即为可溶胶原。1.3.2蛋白定量按酚试剂法测定并调平蛋白质浓度。1.3.3变性加入2%β-巯基乙醇100℃变性1min。1.3.4电泳取20μl蛋白上样，经7.5%聚丙烯酞胺凝胶(SDS-PAGE)电泳2h，电压130v。1.3.5转膜将PAGE凝胶中的蛋白通过电转移槽转移至硝酸纤维素膜上，2h，电压40v。1.3.6封闭TBS洗膜1次，加入含8%BSA的TTBS4℃过夜。1.3.7一抗孵育TBS洗膜3次，每次5min，分别加入山羊抗人、兔抗人多克隆抗体(1∶1000)(Santa公司，美国)，室温下2h。1.3.8二抗孵育加入

6、碱性磷酸酶标记的二抗(1∶200)(北京中山生物公司)，室温4h。1.3.9显色以碱性磷酸酶染色液染色。1.3.10结果分析用自动电泳凝胶成像系统采集图像，应用ScionImage软件对免疫印迹条带进行半定量分析。1.4统计学处理采用SPSS软件(10.0版本，美国)进行统计学分析，P<0.05视为统计学上显著差异。配对比较采用配对t检验。DDH组小儿圆韧带COL1a1的蛋白表达较对照组降低(P<0.01)，COL3a1的蛋白表达与对照组无显著差异(P>0.05)，见图2及表3。表26对DDH组与对照组小儿圆韧带COL1a1、COL3a1m

7、RNA的表达编号性别DDH组对照组年龄（岁）COL1a1/GAPDH*COL3a1/GAPDH**年龄（岁）COL1a1/GAPDH*COL3a1/GAPDH**1男3.10.410.592.61.070.822女3.30.440.662.80.720.633女4.90.580.665.00.890.684男5.00.290.865.00.770.825女6.70.430.757.11.040.716女9.20.410.738.80.980.75配对T检验：*P=0.001；**P=0.556表36对DDH组与对照组小儿圆韧带COL1a1和COL3a1的蛋白

8、表达差异编号性别DDH组对照组年龄3讨论以往的研究发