心脏瓣膜构建关于直接染色法的探讨

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1、心脏瓣膜构建关于直接染色法的探讨-->心脏瓣膜构建关于直接染色法的探讨[摘要]为了快速观察组织工程心脏瓣膜构建中种植细胞的生长状况,采用去细胞猪主动脉瓣叶为支架,将新生牛主动脉内皮细胞种植于其上,第3、7天取瓣叶行H-E直接染色,并以常规切片H-E染色和扫描电镜作为对照。结果发现,该3种方法观察所见细胞第3、7天的生长疏密状况基本同步。提示,瓣叶H-E直接染色可方便快捷地观察种植细胞的生长状况。[关键词]去细胞支架组织工程心脏瓣膜H-E染色[ABSTRACT]Torapidlyobservethegroicroscopyofrecellularizedleafletsedasco

2、ntrol.Theresultsshoethodsilar.Valveleafletsstaineddirectlya公司产品),胎牛血清(杭州四季青公司产品),Triton-X100(Amresco公司产品),0.05%胰酶-0.02%EDTA(Gibco公司产品),RNase和DNase(Sigma公司产品),其他均为国产AR级产品。1.2猪主动脉瓣的去细胞处理清洁条件下取出主动脉瓣,将瓣叶裁剪成直径1cm的圆形,置于含0.05%胰酶-0.02%EDTA的PBS液中,在5%CO2、37℃条件下放置6h后,移入1%TritonX-100的Tris-HCl缓冲液中,4℃放置24h

3、;经RNase和DNase溶液37℃水浴2h,移入含抗生素的保存液中保存。取瓣叶作组织学和扫描电镜观察,并用台式测厚仪测定瓣叶的厚度。1.3新生牛主动脉内皮细胞(BAECs)的培养和鉴定BAECs用酶消化法获取,加入含20%胎牛血清的DMEM培养,细胞80%融合时胰酶消化传代。取第3代细胞行Ⅷ因子染色鉴定,取第3~5代细胞用于实验。1.4细胞种植和培养无菌条件下将去细胞瓣叶圆片置入24孔板中,接种内皮细胞悬液,细胞数目为1×105个,均匀接种。加入20%DMEM培养液,培养7d。第3、7天取瓣叶,行瓣叶H-E直接染色。作为对照实验,另取标本行常规切片H-E染色和扫描电镜观察,内皮

4、细胞Ⅷ因子免疫组织化学染色鉴定。1.5去细胞瓣叶H-E直接染色标本经PBS漂洗后,100%的甲醇-20℃固定20min,PBS漂洗3次,苏木精染色1min,1%稀盐酸溶液分化,温水浸洗5min返蓝,伊红染色10s,梯度乙醇脱水,二甲苯透明后直接镜下观察。2结果2.1去细胞瓣叶支架去细胞猪主动脉瓣叶常规H-E染色,光镜下观察,瓣叶组织表面及中间细胞完全消失,纤维波浪状结构保存完好,扫描电镜可见瓣叶表面粗大的胶原纤维束平行排列,无细胞覆盖。去细胞瓣叶的厚度为(0.70±0.16)mm。2.2BAECs在去细胞瓣叶上的生长状况瓣叶H-E直接染色,细胞种植后第3天,在瓣叶表面生长良好,基

5、本覆盖表面,细胞分布较疏松,间距较大;第7天细胞完全覆盖在瓣叶表面,细胞分布较密集,间距明显变小,无明显的排列顺序。瓣叶常规切片H-E染色,光镜下观察,横切面可见内皮细胞紧贴瓣叶表面生长,形成一层连续细胞层,培养3d的细胞间之间距较培养7d的大(图2A、B),Ⅷ因子免疫组织化学染色阳性。扫描电镜下见瓣叶表面均匀覆盖内皮细胞,细胞呈短梭形、多角形,第3天细胞之间的间距较培养7d的大,无明显的排列顺序3讨论组织工程是运用工程学和生命科学的原理,在多学科范围内构建生物替代品,以维持、恢复、提高组织的功能。它的目标是将自体活细胞种植在天然或人工合成的支架上,最终形成有功能的组织[1]。由

6、于材料的透光性较差,不易在光学显微镜下直接观察种植在其上的细胞生长情况,通常,人们采用标本常规切片H-E染色和扫描电镜观察[2],此两种方法可以明确地观察细胞的生长情况,但它们需要的时间较长,操作较复杂,因而受到一定的限制。为此,采用瓣叶H-E直接染色,观察细胞在瓣叶表面的生长情况。本实验采用去细胞猪主动脉瓣叶作为支架,将BAECs种植在支架上。培养第3、7天,直接在光学显微镜下均不能观察到细胞的生长情况。取其中的瓣叶行H-E直接染色后,可以清楚地发现细胞在支架表面的生长情况:第3天细胞在瓣叶表面覆盖均匀、生长良好;第7天时细胞较第3天明显密集,细胞间距明显变小,无明显的排列顺序

7、。常规切片H-E染色和扫描电镜观察,有着与H-E直接染色相似的发现,表明该3种方法皆可观察细胞的生长情况,细胞第3、7天的生长疏密状况基本同步。应用H-E直接染色法,具有以下优点:(1)快捷方便,需要时间短,只30min左右可观察到细胞的生长情况;(2)操作简单,甲醇固定20min后,简单的H-E染色后即可;(3)定期取标本染色后,可以短时间内动态地观察-->细胞的生长情况。因此,在一定范围内可取代常规切片H-E染色和扫描电镜对细胞进行动态观察。同样,对于用组织工程方法构建其他组