正交试验法优选和丹舒胶囊提取工艺论

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　　正交试验法优选和丹舒胶囊提取工艺论【摘要】目的优选复方和丹舒胶囊中药材的最佳提取工艺。方法采用正交设计法，以水、醇2组提取物中浸膏得率、有效成分(分别为丹参酮ⅡA和黄芪甲苷)提取率为指标，确定提取参数。结果确定黄芪等水溶组药材采用水提，工艺为8倍量水，煎煮3次，每次1.5h;经水提丹参药渣等采用醇提，工艺为6倍量60%乙醇，提取2次，分别提取2.0、1.5h。结论优选的和丹舒胶囊提取工艺稳定、可行，提取率高。【关键词】和丹舒胶囊;丹参酮ⅡA;正交设计;黄芪甲苷;提取工艺OptimizationoftheextractionprocessofHedanshucapsulesbyorthogonaldesign　　ZHANGShu瞝ing1，SHAMei1，LUJun2，XIAChao2　　(1.DepartmentofPharmacy,FujianCollegeofTraditionalChineseMedicine,Fuzhou,Fujian350108,China;2.JiangsuProvinceInstituteofMaterialMedica,Nanjing,Jiangsu210009,China)Abstract:ObjectiveToinvestigatetheoptimalextractionforpoundHedanshucapsules. MethodsOrthogonaltestalconditionforextractingRadixAstragaligroupountofes,1.5hourseachtimeandtheoptimalconditionforextractingRadixSalviaeMiltiorrhizaegroupountof60%alcohol,2times,2.0hoursand1.5hourseachtime.ConclusionTheoptimizedextractivetechnologyisreproduciableandefficient32色谱工作站;SartoiousBT25S型电子分析天平(北京赛多利斯仪器有限公司);恒温干燥箱(北京市朝阳区来广营医疗器械厂);DK睸24型电热恒温水浴锅(上海精宏试验设备有限公司)。丹参、黄芪等实验药材均购自福建同春药业有限公司，经福建中医学院药学系刘小芬讲师鉴定符合2005版中国药典(一部)有关规定;丹参酮ⅡA对照品(批号110766200416)、黄芪甲苷对照品(批号110781200512)由中国药品生物制品检定所提供;甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂为分析纯。　　2方法与结果　　2.1水煎煮组正交试验设计采用正交试验法对黄芪、丹参等药水提工艺进行优选。根据文献报道[2]，以提取次数(A)、提取时间(B)、加水量(C)为试验因素，每个因素3个水平进行优选，以浸膏得率和黄芪甲苷含量作为考察指标进行试验。因素水平见表1。表1水煎煮组的因素水平表论文代写 　　2.2浸膏得率测定精密吸取母液20mL，置干燥恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，于105℃干燥3h，迅速取出，放入干燥器中，冷却30min，迅速精密称定，计算出膏率。　　2.3水煎液中黄芪甲苷含量测定[3]　　2.3.1色谱条件与系统适用性试验色谱柱：DiamonsilTM色谱柱(4.6mm250mm，5μm);流动相：乙腈菜(体积比36∶64);流速：1.0mLmin-1;漂移管温度：105℃;载气流速：2.7Lmin-1。理论塔板数按黄芪甲苷峰计算应不低于4000，分离度大于1.5。　　2.3.2对照品溶液的制备精密称取黄芪甲苷对照品10.16mg，置10mL容量瓶中，加入甲醇定容，制成1.016mgmL-1的溶液，即得。　　2.3.3标准曲线的制备精密吸取对照品溶液0.3、0.5、1.0、2.0、3.0mL，分别置5mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，按2.3.1色谱条件，分别注入液相色谱仪，进样量为20μL，以对照品质量的自然对数为横坐标，以峰面积的自然对数为纵坐标，绘制标准曲线。结果得线性对数方程为Y=2.3157X+65.2485(r=0.9998)，表明黄芪甲苷在1.21～12.19μg范围内线性关系良好。　　2.3.4供试品溶液的制备及测定按表2条件进行提取，合并提取液，滤过，滤液浓缩至1.1 gmL-1，加乙醇使乙醇质量分数达75%，静置24h，取上清液减压回收乙醇，浓缩定容于100mL量瓶中，摇匀。分别精密量取20.0mL，用水饱和正丁醇振摇提取3次，每次25mL，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤3次，每次20mL，正丁醇提取液回收溶剂至干，残渣加甲醇溶液并转移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，离心，取上清液，即得。　　2.3.5含量测定分别精密吸取对照品、供试品溶液20μL，注入液相色谱仪，按2.3.1项下色谱条件测定，计算。　　2.4水煎煮组最佳工艺确定　　对正交试验结果进行极差和方差分析，结果见表2、表3。表2水煎煮组正交试验结果注：综合评分=(出膏率/最大出膏率)1000.4+(黄芪甲苷含量/黄芪甲苷最高含量)000.6表3水提工艺方差分析表注：F0.05(2，2)=19.000　　由表2可知，3个因素的极差大小顺序为A>C>B，提取次数对提取工艺的影响最大，其次为加水量，提取时间影响最小。由表3可知，因素A对本复方的提取有显著性影响，因素B、C无显著性影响。故最佳工艺为A3B1C1，即用8倍量水，提取3次，每次1.5 h。按优选的最佳工艺提取3批样品进行验证实验，可知，3批样品出膏率分别为22.14%、21.09%、22.47%，黄芪甲苷含量分别为1.91、1.85、1.89mgg-1，验证结果表明工艺基本稳定可行。　　2.5醇提组正交试验设计　　根据文献和预实验结果[4]，采用正交试验设计，对乙醇浓度(A)、醇用量(B)、提取时间(C)3个试验因素，每个因素3个水平进行优选，并以浸膏得率和丹参酮ⅡA含量作为考察指标进行试验。因素水平表见表4。　　2.6丹参酮ⅡA含量测定　　2.6.1色谱条件色谱柱为HypersilODS2(4.6mm250mm，5μm);流动相为甲醇菜(体积比82∶18);检测波长为270nm，流速为1.0mLmin-1，柱温为30℃。理论塔板数按丹参酮ⅡA峰计算应不低于3000。　　2.6.2对照品贮备液的制备精确称取丹参酮ⅡA5.12mg，置5mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，丹参酮ⅡA的质量浓度为1.024mgmL-1。表4醇提组的因素水平表　　2.6.3线性关系考察精密吸取对照品储备液0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0mL置10mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精密吸取各对照品液10μL进样，按2.6.1项下色谱条件测定峰面积，以对照品的进样量(μg)为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归分析，得丹参酮ⅡA回归方程为Y=473217X+9122(r=0.9999)，线性范围为0.1024～1.024μg。 　　2.6.4样品溶液的测定用L9(34)正交表安排试验，称取处方量的药材，按设定方案进行回流，收集回流提取液，定容至200mL，精密量取50mL，置已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，于105℃干燥3h，置干燥器中冷却0.5h，迅速称量。精密称定，精密加入流动相50mL，称定重量，避光超声处理30min，放冷，再称定重量，用流动相补足减失的重量，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过。精密量取续滤液1mL，用甲醇定容于100mL容量瓶中，即得。分别精密吸取对照品、供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，按2.6.1项下色谱条件测定。　　2.7醇提组最佳工艺确定正交试验结果见表5，方差分析结果见表6。　　由表5可见，3个因素的极差大小顺序为C>A>B，提取时间对提取工艺的影响最大，醇浓度次之，醇用量影响最小。由表6可见，提取时间对提取效果有显著性影响，醇浓度、醇用量无显著性影响。考虑生产成本，确定A1B1C3为最佳工艺，即用6倍量60%乙醇溶液，提取2次，提取时间分别为2.0、1.5h。按优选的最佳工艺提取3批样品进行验证实验可知，3批样品出膏率分别为20.24%、20.32%、19.97%，丹参酮ⅡA含量分别为0.941、0.937、0.931mgg-1，验证结果表明工艺基本稳定可行。表5 醇提组正交试验结果注：综合评分=(浸膏得率/最大浸膏得率)1000.4+(丹参酮ⅡA含量/丹参酮ⅡA最高含量)1000.6　表6醇提工艺方差分析表　　3讨论　　丹参味苦微寒，具活血凉血、祛淤清热之功，为本方君药以祛淤阻。丹参主要含有两类成分：一为脂溶性的二萜醌类，具有抗菌、抗炎及扩张血管作用;另一类为水溶性的酚酸类化合物，具有明显的抗凝、溶纤及很强的抗脂质过氧化作用。方中黄芪则取补气之功而治前列腺增生日久气虚之候，其利水之功又可助它药以泄湿，故水提组以黄芪甲苷作为指标成分。黄芪等药味中的活性成分在水中有较好的溶解度，故考虑用传统的水煎煮提取;而经水提丹参药渣、牛膝等药物的有效成分在醇溶液中溶解度较大。故采用醇提与水提方法相结合，可同时对复方中药材的脂溶性及水溶性有效成分进行全面提取。　　在供试品溶液的制备上，比较了加甲醇超声20、30min，水浴回流提取20、30、60min及加乙醚索氏提取等多种方法的提取效果。结果显示，超声30min、水浴回流提取20min及乙醚索氏提取3h，丹参酮ⅡA即可提取完全，甲醇提取法制得的样品溶液较索氏提取法制得的样品溶液所含杂质为多，但杂质成分对测定丹参酮ⅡA无干扰。为方便提取，故选定超声30min进行提取。 　　和丹舒胶囊为复方制剂，成分复杂。试验选择以浸膏得率和黄芪甲苷、丹参酮ⅡA含量测定为指标，可综合评价提取工艺的合理性。采用正交设计的试验方法对提取工艺进行优化筛选，确定的最佳提取工艺简便、科学，符合生产要求。【