岩藻糖转移酶基因转导对人卵巢癌细胞信号通路

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1、岩藻糖转移酶基因转导对人卵巢癌细胞信号通路1引言卵巢癌是妇科死亡率最高的恶性肿瘤，化学药物治疗仍是术后治疗的主要手段，虽然以铂类为主的联合化疗提高了卵巢癌患者的总体反应率，但随之而来的肿瘤细胞的耐药成为困扰临床治疗的主要障碍。因此了解卵巢癌细胞的发生、发展及耐药机制，有助于探索对卵巢癌治疗的新靶点，提高卵巢癌的生存率。　　Leitogen-activedproteinkinase，p38MAPK)信号途径的关系，探讨Leresco公司产品；二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司；AnnexinⅤ-FITC试剂盒为晶美生物工程有限公司产品；p-p38MAPK(phosph-p

2、38MAPK)、p38MAPK和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cysteinylaspartatespecficprotease,caspase-3)抗体均购自美国Santacruz公司；抗Le公司，在细胞培养液中的终浓度是10ug/ml，无交叉反应，该抗体适合做免疫组化。p38MAPK特异性抑制剂SB203580购自英国Promage公司；RT-PCR试剂购自日本TaKaRa公司。ECL发光试剂盒购自美国Pierce公司。　　2。3主要仪器流式细胞仪FACSCalibur为美国BectonDickinson公司产品；倒置荧光显微镜IX71为日本OLYMPUS公司产品；PCR仪为日

3、本TaKaRa公司产品。　　3方法3。1细胞培养及制备细胞在含10%胎牛血清DMEM培养液中培养，0。25%胰蛋白酶及0。02%EDTA消化传代，取指数生长期细胞用于实验。　　3。2荧光染色法取指数生长期细胞，接种于6孔板，接种浓度保证细胞在同一时间生长至约占底面积1/3，行同步化处理。p38MAPK抗体终浓度为2ug/ml，p-p38MAPK抗体终浓度为4ug/ml，二抗浓度均为2ug/ml，另设阴性对照组。弃上清，每孔加入4%多聚甲醛300μl室温20min后加入封闭用羊血清工作液100μl，37℃封闭30min，加一抗50μl4℃过夜，避光加二抗30&mu

4、;l，荧光倒置显微镜(400)观察并照相。　　3。3RT-PCR法分别提取细胞总RNA，紫外分光光度计测定RNA的纯度和浓度，RT-PCR操作按照RT-PCR试剂盒说明书进行。PCR扩增条件见Table1。同时扩增管家基因β-actin作为对照验证，产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测。紫外灯下观察并拍照，每个样本重复3次。　　3。4APK、p-p38MAPK、caspase-3抗体，室温3h，然后用1:8000稀释的HRP标记的山羊抗兔或山羊抗鼠IgG二抗室温3h。ECL试剂显色：等比例混合ECL试剂盒中的A液、B液，与膜反应1min，显影，定影，测蛋白条带的灰度值。　　3。

5、5流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡p38MAPK特异性抑制剂SB203580处理RMG-I-H细胞：选取指数生长期RMG-I-H细胞制成单细胞悬液，以2105/培养皿接种于35mm培养皿中，培养细胞接种至培养皿36h后弃去10%胎牛血清的培养液，加入含0。1%DMSO的SB203580培养液，浓度分别为0。1mM，1mM，10mM，另设同样浓度的0。1%DMSO为对照组，继续培养24h，收集细胞。　　按Annexin-V-FICT/PI试剂盒操作说明染色，利用流式细胞仪进行检测。　　3。6统计学处理采用SPSS13。0软件进行统计分析。计数资料用t检验。P<0。05视为有统

6、计学意义。　　4结果。1p38MAPK、p-p38MAPK在细胞内的定位分析利用荧光染色法检测RMG-I与RMG-I-H细胞p38MAPK、p-p38MAPK表达的定位，结果显示RMG-I与RMG-I-H的p38MAPK蛋白定位在细胞质和细胞核，以细胞质为主(FIG。1。A,B)，p-p38MAPK蛋白定位在细胞核(FIG。1。C,D)。　　4。2两种细胞系中FUT-1、p38MAPK、caspase-3基因的表达利用RT-PCR法分别检测RMG-I与RMG-I-H细胞中FUT-1、p38MAPK、caspase-3基因的表达情况，结果显示：FUT-1基因在RMG-I-H细胞中的

7、相对表达强度明显高于RMG-I(P<0。05)(FIG。2A)；p38MAPK基因在RMG-I-H细胞相对表达强度也明显高于RMG-I(P<0。05)(FIG。2B)；而caspase-3基因在RMG-I-H的相对表达强度明显低于RMG-I(P<0。05)(FIG。2D)。　　4。3两种细胞系中p38MAPK、p-p38MAPK、caspase-3蛋白的表达利用G-I与RMG-I-H细胞p38MAPK、p-p38MAPK及caspase-3蛋白的表达，结果显示：