比色法测定知母总皂苷含量

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1、比色法测定知母总皂苷含量　知母为百合科植物知母AnemarrhenaasphodeloidesBge.的干燥根茎,性寒，味苦甘，具有清热泻火、生津润燥之功效，用于外感热病、高热烦渴、肺热燥咳、骨蒸潮热、内热消渴、肠燥便秘［1］。知母甾体皂苷是主要有效成分之一。药理研究表明，知母甾体皂苷具有“抗血小板聚集作用”［2］“上调脑M2受体及总M受体”［3］“对β受体调整作用”［4］“降低心率”“降血压”“对心肌缺血/复灌注损伤的保护作用”［5］“降血糖”［6］等作用。目前，测定知母总皂苷的方法主要有比色法。本文采

2、用比色法，对不同显色体系进行了考察，测定知母皂苷提取物中的皂苷类物质含量，为知母提取物的质量控制研究提供参考依据。　　1仪器与材料　　TU-1901双光束紫外可见分光光度计（北京通用），香草醛（3-甲氧基-4-羟基苯甲醛）、茴香醛（对甲氧基苯甲醛）、对二甲氨基苯甲醛、无水乙醇、甲醇、硫酸等均为AR.级。知母皂苷AⅢ对照品（上海第二军医大学药学系提供，高效液相归一化方法测纯度为97.2%）知母药材提取物，共9个批号（060512，060515，060521，060622，060728，060808，0608

3、16，060908，060928），本试验室自行提取分离。　　2方法与结果　　2.1对照品溶液精密称取知母皂苷AⅢ对照品适量,加甲醇溶解并制成每毫升约含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。　　2.2供试样品溶液精密称取知母提取物粉末100mg，置50ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，制成每毫升约含2mg的溶液，作为供试品溶液。　　2.3显色剂的选择为考察最佳显色剂，参考文献报道［7］，考察了香草醛、茴香醛、对二甲氨基苯甲醛等显色剂的显色效果和稳定性，配制方法和用量分别为：　　A：1%香草醛无水乙醇溶液1

4、ml+硫酸-无水乙醇（7→10）1ml；　　B：0.5%茴香醛硫酸溶液0.5ml（0.1ml茴香醛+1ml硫酸+18.9ml无水乙醇）；　　C：0.35mol/L对二甲氨基苯甲醛水溶液1ml＋0.08mol/L盐酸乙醇1ml；　　方法：精密吸取对照品溶液、供试品溶液各100μl，置10ml具塞试管中，挥干溶剂，取出，分别按上述方法加入不同的显色剂，振摇均匀后，置100℃水浴中加热5min，取出，立即置冰水浴中放置5min，各管精密加入无水甲醇10ml，摇匀，分别以各显色试剂同样操作管为空白，照分光光度法（

5、《中国药典》2005年版Ⅰ部附录ⅤA）进行扫描，测定最大吸收波长处的吸收度。每隔5min测定一次，观察30min内吸收度的稳定性。结果见表1。表1几种显色剂的显色效果及稳定性（略）　　结果表明，香草醛为显色剂时稳定性较差，对二甲氨基苯甲醛不显色，故选择以茴香醛作为显色剂，并进一步考察各种因素对显色的影响。　　2.4显色温度的影响精密吸取8份对照品溶液100μl，至具塞试管中，挥干溶剂，取出，分别加0.5%茴香醛硫酸溶液0.5ml,各取2份分别在25℃，60℃，80℃和100℃下反应15min，取出，立即置

6、冰水浴中放置5min，精密加入无水甲醇10ml，摇匀，分别以各温度下的试剂管为空白，测定最大吸收波长和吸光度。结果表明，反应温度对最大吸收波长无影响，均在430nm和504nm波长处有最大吸收，但随着温度升高，430nm处吸收度下降，504nm处吸收度升高，而在100℃条件下吸收度最高，较为灵敏，故选择反应温度为100℃，测定波长430nm。　　2.5显色时间的影响精密吸取6份对照品溶液100μl，在反应温度100℃条件下，考察了反应时间5，10，15min对吸收度的影响，以及吸收度的稳定性。结果见表2。

7、结果表明，100℃反应5min的吸收度较高，30min内的稳定性较好，故选择100℃条件下，反应时间5min为宜。表2反应时间对显色的影响及稳定性（略）　　2.6线性范围考察分别精密吸取对照品溶液50，100，150，200，250，300μl，至具塞试管中，挥干溶剂，取出，分别加0.5%茴香醛硫酸溶液0.5ml,在100℃水浴中反应5min，取出，立即置冰水浴中放置5min，精密加入无水甲醇10ml，摇匀，以试剂管为空白，在430nm波长处测定吸收度，以对照品加入量为横坐标，吸收度为纵坐标，计算回归方程

8、。结果表明，知母皂苷AⅢ在25～150μg范围内，呈线性关系，回归方程Y＝3.7458X-0.0377(Y为吸收度,X为对照品毫克数)，r＝0.9998。　　2.7精密度实验按“2.6”项下方法，精密吸取对照品溶液0.5ml，重复测定，计算6次测定结果的平均值和相对标准偏差，评估方法的重复性。结果表明，本方法的重复性较好，RSD小于2.0%。　　2.8含量测定精密称取知母提取物约100mg，置50ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至