不同相对分子质量海带岩藻聚糖硫酸酯内皮细胞

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1、不同相对分子质量海带岩藻聚糖硫酸酯内皮细胞岩藻聚糖硫酸酯（fucoidan)是一种水溶性硫酸杂聚糖,是褐藻特有的一种化学组分。据初步的药理研究发现1—8,它具备抗凝血、抗肿瘤、抗HIV、抗血栓、提高免疫力、降血脂等多种医学功效,是当今天然海洋药物研究的重点之一。血栓形成的最主要因素是血管受到损伤,其中首当其冲的就是血管内皮细胞的损伤5。因此,判断一种药物是否可作为理想的抗血栓药物,也应该对其是否具有保护血管内皮细胞的功能进行考察。有报道称,海带中提取的高分子杂多糖对血管内皮细胞可能具有保护作用6,在的前期研究中,发现中、低相

2、对分子质量的海带岩藻聚糖硫酸酯均具有良好的抗血栓作用—]。而其是否对内皮细胞具有保护作用，尚待进一步研究。本实验同时采用体内研究和体外研究的方法,考察不同相对分子质量海带岩藻聚糖硫酸酯对内皮细胞的保护作用，并探讨其作用机制,为开发抗血栓新药提供理论支持。1材料1.1动物SD大鼠,雄性,清洁级,200~250g青岛市药检所实验动物中心,动物生产许可证号:SCXK(鲁）20090007]。1.2细胞株人脐静脉内皮细胞（humanumbilicalveinendo¬thelialcell,HUVEC,上海泛柯生物科技公司）细胞株取

3、自人脐带静脉组织,为原代冻存细胞。1.3药品与试剂4种岩藻聚糖硫酸酯（中国海洋大学食品科学与工程学院）。相对低相对分子质量岩藻聚糖硫酸酯（looleculariddlemolecularol•L-1溶液备用。血管性血友病因子测定药盒（上海船夫生物科技有限公司）；水合氯醛、磷酸盐缓冲液(PBS)及其他试剂均为国产分析纯。大鼠抗人单克隆抗体CD31—PE、CD514TTC(美国Invitrogen公司）;高糖DMEM培养基（美国Gibco公司）；小牛血清（杭州四季青生物工程材料公司）;胰蛋白酶（美国DFICO公司）；肿瘤坏死因子

4、（TNF—a)(华美生物工程有限公司）；鞘液（美国BECKMANCOUL¬TER公司，ISOTON1);标准荧光微球（美国BECK-MANCOULTER公司,FLORAS公司，日本）；高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂,TGL-16G-A);全自动酶标仪（BECKMANCOULTER公司,AD340,美国）；CO2孵育箱（美国ThemroFomra公司，Model311);流式细胞仪（美国BECKMANCOULTER公司，EpicsXL•MCL)。2方法2.1分组与给药大鼠随机分为正常对照组、模型组和4个岩藻聚糖磷酸酯组（分

5、别为LF1组、LF2组、MFa组和MFb组），每组10只，全部为雄性。正常对照组和模型组腹腔注射给予1mL•100g-1生理盐水,其他各组分别腹腔注射给予岩藻聚糖硫酸酯0.01ol•kg-1,每日1次,持续5d。2.2大鼠内皮损伤模型制作3各岩藻聚糖硫酸酯实验组和模型组分别在每日早、中、晚于背部相同部位皮下注射肾上腺素（0.4mg•kg—1),正常对照组皮下注射等量生理盐水，持续5d。每日早晨给药1h后麻醉,腹主动脉取血约2mL,置枸橼酸钠抗凝管（抗凝剂与血样体积比为1:9)中备用。2.3病理学切片制作大鼠取血后,快速分离

6、胸主动脉,先用磷酸盐缓冲液冲洗干净管腔内的血液，再用4%多聚甲醛固定24h。横截切取主动脉弓下血管段约0.5cm,经包埋后切片，切片厚度5pm。经HE染色后,进行脱水透明、封固，备用。2.4内皮损伤情况切片观察和血管性血友病因子(vEM培养液约5mL,培养瓶中接种,每3~4d换液1次。待内皮细胞生长铺满瓶底后即可传代。吸去培养基，用无血清RPMI16402mL洗培养瓶1次。加入0.1%胰酶、0.02%EDTA-Na-3mL,放CO2孵育箱（5%CO2,37°C)中培养,隔天换液,约4d进行1次消化传代。取对数生长期细胞,经消

7、化、离心后,弃去上清液,加入冻存液,调节细胞约为1x107个•L―1,冷冻,备用。2.6vPs指标检测2.6.1vFa组:培养液中加入MFa和肾上腺素,使最终浓度分别为0.01ol•L-1和10g•L-1;⑥MFb组:培养液中加入MFb和肾上腺素,使最终浓度分别为0.01ol•L-1和10g•L-1。分别在加药后的24和48h取100上清液，采用酶联免疫吸附试验（ELISA),按照试剂盒说明测定vPs检测将体外培养生长良好的内皮细胞按5x105个接种于24孔细胞培养板,并随机分为下列各组,每组样本数为3。接种24h后弃去

8、上清液,按以下实验分组要求加入实验培养液:①正常对照组：加入完全培养液；②模型组：培养液中加入TNF-a(100ng•mL-1)；③LF1组：培养液中加入LF1和TNF—a,使最终浓度分别为0.01ol•L-1和100ng•mL-1;④LF2组：培养液中加入LF2和TNF—a,使最终浓度