大鼠胰腺发育过程中munc13

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时间:2018-10-29

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1、大鼠胰腺发育过程中Munc13  【Abstract】AIM:ToinvestigatetheexpressionofMunc131duringvariousstagesofembryonicpancreaticdevelopmentinratsanddefinetheeffectofMunc131oninsulinsecretion.METHODS:Pancreataofratembryonicday12.5(E12.5),E15.5,E18.5,neicroscoperespectively.Inaddition,theanimalmodelsofintrauteri

2、negroadeby50%calorierestrictioninpregnantratsfromgestationalday15untilterm.AfterabstractionoftotleRNAandprotein,thetechniquesofRTPCR,realtimePCR,unc131基因及蛋白表达的变化及Munc131在胰岛素释放过程中的作用.方法:应用显微分离及提取技术获得大鼠胚胎发育12.5d(E12.5),E15.5,E18.5,新生大鼠,出生后21d(P21)及成年大鼠胰腺组织;另外,从大鼠胚胎发育15d开始给予孕鼠半量饮食,造成宫内发育迟缓动物

3、模型,提取其新生大鼠胰腺组织.采用RTPCR,RealtimePCR和unc131的表达情况,并测定不同发育时期血中胰岛素浓度.结果:胰岛素基因从E12.5开始出现,Munc131基因从E15.5开始表达,随着胎龄的增长,二者表达量皆增多.E15.5和E18.5时munc131蛋白表达量较少,以后明显增多.自E18.5即检测到血中胰岛素的存在,随着胚胎的发育,血胰岛素浓度逐渐升高.宫内发育迟缓新生大鼠比正常新生大鼠血胰岛素浓度低,同时Munc131基因及蛋白表达量亦比正常对照组明显减少.结论:Munc131在胰岛素释放过程中的作用,随着胚胎发育期胰岛素分泌的增多表达也增加

4、,宫内发育迟缓新生大鼠胰岛素分泌减少时,Munc131的表达亦减少.  【关键词】Munc131;胰岛素/分泌;胚胎胰腺发育;糖尿病;宫内发育迟缓  0引言  胰岛素在β细胞内合成后,以分泌颗粒的形式贮存在大致密囊泡中,在营养物质(葡萄糖、氨基酸、脂肪酸等)、神经递质、激素等刺激下,进入血循环,完成其调节体内营养物质代谢,调节生长发育,控制血糖动态平衡的生理作用[1-2].业已证实,胞吐过程是涉及许多蛋白因子的复杂过程,可溶性N甲基马来酰胺融合蛋白附着蛋白受体(solublehylmaleimidesensitivefusionproteinattachmentprote

5、inreceptors,SNARE)复合体是胞吐过程所必须的分子构件;Munc,Synaptotagmin,Rab等蛋白家族的不同成员是其重要的调节因子.这些因子在神经递质胞吐中研究得较多,但他们在胰岛素分泌过程中的确切作用及其精细功能如何尚无定论[3-5].我们运用基因芯片技术,已建立了大鼠不同发育阶段基因表达谱,初步明确了胰岛素释放的完善过程中相关基因的表达情况,在此基础上,我们重点从胰岛素释放关键因子之一Munc131入手,探讨正常及异常胰腺发育情况下Munc131表达的变化,阐述其在胰岛素释放过程中所起的重要作用,以期寻找糖尿病治疗的新靶点.  1材料和方法  1

6、.1材料SD大鼠由南京医科大学实验动物中心提供.18:00将雌雄鼠合笼,次日晨检测有阴栓者定为孕0.5d(E0.5),分别于受精后12.5d(E12.5),15.5d(E15.5),18.5d(E18.5),经颈椎脱臼处死孕鼠,剖腹取出孕子宫,分离胚胎,取出胰腺(E12.5,E15.5胚胎胰腺需在解剖显微镜下分离),新生鼠出生后,立即与母体分离,迅速取出其胰腺.出生后21d鼠和成年鼠在低温条件下迅速取出胰腺[6].部分孕鼠于E15开始给予正常卡路里的50%,直至出生,造成宫内发育迟缓动物模型,待新生鼠出生后,立即取出其胰腺.所有标本置液氮中速冻后-70℃冻存备用.分别取E

7、12.5胚胎胰腺100只、E15.5胚胎胰腺30只,E18.5胚胎胰腺10只(来自3只孕鼠),新生鼠3只(来自3只孕鼠),用RneasyMiniKit(Qiagen公司)抽提并纯化总RNA.总RNA分装后-70℃冻存,用于RTPCR和RealtimePCR.  1.2方法RTPCR和RealtimePCRRTPCR操作过程按试剂盒(日本Toyoko公司)提供常规步骤.目的基因及内参照引物序列如下:G3PDHforePCR探针设计如下:unc13h1fam:CCAAGCCATGACCCACTTTGCCTG,unc13h1fp:C

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