tnfα基因863位点单核苷酸多态性与宫颈癌以及hpv感染的关系

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1、TNFα基因863位点单核苷酸多态性与宫颈癌以及HPV感染的关系：尉春艳，吴静，张熙，张菊，高艳娥【摘要】目的探讨TNFα基因863位点的单核苷酸多态性与宫颈癌以及HPV感染的关系。方法采用模板介导的染料终止物掺入荧光偏振检测(TDIFP)的方法对59例宫颈癌以及22例对照进行TNFα基因863位点的单核苷酸多态性检测。结果宫颈癌组的TNFα基因863位点A等位基因频率(39.0%)较对照组(14.6%)明显升高(P<0.01，OR=2.673，95%CI：1.300～5.497)；AA基因型在

2、宫颈癌组和对照组中分别为15.3%和0，差异显著(P<0.05)；CA基因型在两组中分别为47.5%和29.2%，差异显著(P<0.05)；A等位基因频率在HPV阳性者与HPV阴性者之间没有显著性差异(P>0.05，OR=1.950，95%CI：0.840～4.527)，但是在HPV阳性者中具有增高趋势(37.5%)，高于HPV阴性者(19.2%)。结论TNFα基因863位点A等位基因以及CA、AA基因型与宫颈癌的危险性升高有关，与HPV感染危险性无关。【关键词】肿瘤坏死因子α；宫颈肿瘤；人乳

3、头瘤病毒；单核苷酸多态性；荧光偏振ABSTRACT:ObjectiveToanalyzetherelationshipbetorphismoftumornecrosisfactorα(TNFα)geneatthesiteof863.MethodsTDIFPorphismofTNFαgeneatthesiteof863in59casesand22controls.ResultsThepositiverateofAalleleat863ingroupofcervicalcancer(39.0%)orphism

4、at863doesnotattributetoHPVinfection.KEYTEasyVectorSystemⅠ(美国Promega公司)；GenEluteTMPlasmidMiniprepKit(美国Sigma公司)；DH5α菌株(第四军医大学全军基因诊断研究所提供)；96微孔板(美国MJResearch公司)；PCR扩增仪、荧光偏振检测仪、荧光偏振检测试剂盒(美国PerkinElmer公司)。根据GenBank收录的TNFα基因序列设计包含TNFα863位点的引物和TDI探针，扩增片段长171bp，

5、P1：5′TGTGACCACAGCAATGGGTAGGAGA3′，P2：5′CCCAGTGTGTGGCCATATCTTCTTA3′，TDI探针：5′TCGAGTATGGGGACCCCC3′，由上海生工生物技术有限公司合成。1.3阳性对照的建立用酚/氯仿法粗提DNA并以此为模板，进行PCR基因扩增(上、下游引物各1.0μL，5.0μL模板DNA，0.5μLTaq聚合酶，1.5μLdNTPs，2.5μLMgCl2，2.5μL10×Buffer，11.0μL双蒸水；扩增条件：95℃5min，94℃30s，5

6、4℃40s，72℃30s，总共35个循环，72℃10min)，取10μLPCR反应产物进行15g/L的琼脂糖凝胶电泳，切胶并称重，参照T载体，1.0μLT4DNA连接酶，2×T4连接酶缓冲液5.0μL，参照pGEMTEasyVectorSystemⅠ试剂盒说明书进行连接反应。将5.0μL的连接产物加入100μL的DH5α感受态细菌，培养过夜后，连续收集共10mL菌液的菌体，参照GenEluteTMPlasmidMiniprepKit质粒提取试剂盒说明书提取质粒DNA，由上海生工生物技术有限公司测序鉴定。1.

7、4TDIFP法检测863位点的多态性59例宫颈癌新鲜组织块和22例宫颈炎患者宫颈管分泌物初步处理后，PCR基因扩增(反应体系、条件同阳性对照建立中的PCR)，取反应产物15.0μL，加入以1∶9的比例混合PCRCleanupReagent和PCRCleanupDilutionBuffer6.0μL，吹打混匀，37℃水浴2h后95℃4h，以消化PCR反应中剩余的引物和dNTPs；将消化后的产物按照每管7.0μL分装于两个干净微量离心管中，分别加入已配好的掺入反应混合物(0.5μL点突变检测探针，1.5μLA

8、cyclopolTerminatorMIX，0.05μLAcyclopol聚合酶，2.0μL10×Buffer，8.95μL去离子水)各13.0μL，95℃变性2min，94℃15s，49℃30s，53℃30s，总共30个循环，15℃延伸10min，以掺入检测点突变的探针；将掺入产物10μL加入96孔微孔板，置于荧光偏振检测仪VictorMultiLabelCounter