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时间:2018-10-28
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1、Survivin和COX【关键词】移行膀胱癌;Survivin;COX-2 Abstract:ObjectiveToexploretheexpressionofSurvivinandCOX-2inhumanbladdertransitionalcellcarcinoma(BTCC)andthebiologicalsignificance.MethodsImmunohistochemicalS-PmethodandRT-PCR、albladdermucosa.ResultsTheexpressionoftheSurvivinandCOX-2inhumanBTCCalbladdermucosa
2、(P<0.01).Thereongdifferentclinicalstages(P<0.05).ThesignificantdifferenceintheexpressionofSurvivinandCOX-2amongthedifferentpathologicalgradess;survivin;COX-2膀胱移行细胞癌(BTCC)的浸润和转移进程复杂,与多种癌基因和抑癌基因的表达、调控以及细胞凋亡有关。Survivin基因是近年来发现的凋亡抑制基因;COX-2基因是与抑制肿瘤转移相关的基因,它们对多种肿瘤的转移有调控作用。本研究应用SP免疫组化方法和RT-PCR检测了40例膀胱癌和10
3、例正常膀胱组织标本的Survivin和COX-2的表达,探讨其表达与BTCC临床分期、病理分级的相互关系,为临床正确估计预后和治疗提供依据。 1材料与方法 1.1研究对象宁夏医学院附属医院泌尿外科2006年1月—2006年12月电切和开放手术治疗的BTCC患者40例,其中男20例,女20例,年龄31~80岁,平均62岁。经尿道膀胱肿瘤电切(TURBt)20例,膀胱部分切除10例,膀胱全切10例。病理分级按标准,其中T1期12例,T2期15例,T3期13例。组织学分类:40例均为BTCC。从10例行开放手术的前列腺增生(BPH)患者取膀胱组织标本作对照。 1.2染色方法所有标本均经10%的
4、多聚甲醛固定、石蜡包埋并进行连续超薄切片,分别作苏木精2伊红(HE)染色、免疫组织化学SP染色。所有标本均由两位病理学专家确诊。所有一抗均购自Maixin公司,SP试剂盒由福州迈新生物技术开发有限公司提供。所有操作严格按试剂盒说明进行。石蜡切片脱蜡,水化后行免疫组织化学染色。抗体工作浓度Survivin为1∶100,COX-2为1∶200,最后用二氨基联苯氨(DAB)染色,苏木精复染。以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照,已知阳性标本作为阳性对照,阳性标本显色后,立即全部终止反应。 1.3结果判断Survivin、COX-2阳性表达为胞浆成棕黄色。在切片阳性细胞区随机挑选10个高倍视
5、野共计数1000个肿瘤细胞,按照文献[1]方法,在高倍镜下对染色作如下评分:①染色深浅:无着色为0分,淡黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分;②染色细胞计数:没有细胞染色为0分,1%~10%为1分,11%~33%为2分,34%~66%为3分,>66%为4分。两项结果相加<2分为阴性(-),2~3分为弱阳性(+),4~5分为中度阳性(6),6~7分为强阳性(7)。 1.4RT-PCR检测Survivin、COX-2mRNA的表达分别收集培养的各组细胞,按Trizol试剂盒说明书提取总RNA,取1μg总RNA反转录合成cDNA,再取20μL反转录产物进行PCR循环。Survivin引物序列:上
6、游5′-ACAACCAAACCTCACACTACTG-3′,下游5′-ATAGATCCCATTACAGACAGCG-3′。COX-2引物序列:上游5′-GGATTTTTATTTAAGAGGAGTAGGT-3′,下游5′-CTACCAAAATTTTTATTATAATCCC-3′。Survivin产物长度439bp,COX-2产物长度468bp,94℃变性1min,60℃复性30s,72℃延伸40s,共35个循环,末次循环72℃延伸10min。GAPDH引物序列:上游5′-TCACCATCTTCCAGGAGCGAG-3′,下游5′-TGTCGCTGTTGAAGTCAGAG-3′,产物长度648bp
7、,94℃变性1min,55℃复性30s,72℃延伸40s,共30个循环,末次循环72℃延伸10min。反应结束后取反应产物5μL进行20g/L琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,UVP型凝胶图像分析系统做图,以各组目的基因与GAPDH基因灰度的比值代表Survivin、COX-2mRNA的表达量。 1.5数据分析各样本测定值以平均值±标准差表示,以统计学软件SPSS11.0进行分析,采用Fisher确
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