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1、STAT3?SURVIVIN途径介导槲皮素调控胃癌细胞增殖和凋亡【摘要】目的:观察STAT3?SURVIVIN途径在槲皮素调控胃癌细胞SGC7901增殖和凋亡中的作用.方法:不同浓度的槲皮素及阳性对照组(AG49040μmol/L)作用细胞后,MTT法检测细胞毒作用;流式细胞术检测细胞凋亡;RealtimeRT?PCR,I?1640,槲皮素,DMSO,AG490购自Sigma公司;胎牛血清购自杭州四季青公司;MTT购自Inventrogen公司;总RNA柱式提取试剂盒购自BBI公司;RealTimePCR试剂盒购自宝生物工
2、程（大连）有限公司.Stat3上游引物:5′?CCAGTCAGTGACCAGGCAGAAG?3′,下游引物:5′?GCACGTACTCCATCGCTGACA?3′,扩增产物114bp；survivin上游引物:5′?AGGTCATCTCGGCTGTTCCTG?3′,下游引物:5′?TCATCCTCACTGCGGCTGTC?3′,扩增产物127bp;内参照GAPDH上游引物:5′?GTGCTTTGACAAATCCCATCTGA?3′,下游引物:5′?GTTACTGTCCCGGATCTTGTCCA?3′,扩增产物138bp,均
3、由宝生物工程（大连）有限公司合成.兔抗人stat3多克隆抗体购自CellSignal公司;兔抗人survivin多克隆抗体购自SantaCruz公司. 1.2方法 1.2.1细胞培养及MTT法检测细胞毒作用SGC7901细胞于含100mL/L胎牛血清的RPMI?1640培养基中培养,37℃,50mL/LCO2孵箱中贴壁生长,2.5g/L胰酶消化传代.实验分为空白对照组,阴性对照组（0.5mL/LDMSO），阳性对照组（AG49040μmol/L），槲皮素4个浓度组（20,40，80，160μmol/L）.取同一批次对数
4、生长期细胞制成单细胞悬液,5×103/孔接种于96孔板,每组设4个复孔.24h细胞贴壁后,弃培养液,加200μL/孔无血清培养基同步化24h,再次吸弃培养液,加无血清培养基180μL/孔及各组药物,使终体积为200μL/孔,终浓度为所需值.分别于加药后24,48,72h测吸光度值A(λ=490nm).抑制率计算公式：细胞抑制率(%)=(1-A处理组/A对照组)×100%.计算IC50值,选择3个浓度进行后续实验. 1.2.2流式细胞仪检测细胞凋亡实验分为阴性对照组、阳性对照组、槲皮素（40μmol/L）组.细胞以5×10
5、5/mL的浓度接种于50mL培养瓶，每组3瓶.处理步骤同上.加药后48h胰酶消化，收集细胞,离心（800r/min，5min）,弃上清,加PBS液至总体积为1.5mL/管,上流式细胞仪（双染法）检测细胞凋亡. 1.2.3RealTimeRT?PCR检测stat3和survivin基因mRNA的表达实验分为阴性对照组、阳性对照组、槲皮素(20,40,80μmol/L)组.细胞处理同上.收集48h细胞，用EZSpinColumn提取细胞总RNA,RealTimeRT?PCR反应参照试剂说明书进行. 1.2.4SF)液裂解后
6、抽提总蛋白,Bradford法测定蛋白浓度.取变性蛋白样品50μg上样,SDS?PAGE电泳后转PVDF膜,半干标准转膜45min.漂洗后,加入ageproplus软件进行杂交信号累计吸光度(IOD)分析. 统计学处理:计量资料采用x±s,统计软件采用SPSS11.5分析,多个样本均数比较采用方差分析,两两比较用Dun?t检验,两变量间关系分析采用直线相关分析法. 2结果 2.1槲皮素抑制SGC7901细胞的增殖20～160μmol/L槲皮素对胃癌SGC7901细胞的增殖均有抑制作用,且有随作用时间延长而抑制作用增强
7、、随浓度增高抑制率增高的趋势(图1). aP<0.05vs空白对照.(责任编辑：admin) 图1槲皮素(Que)对SGC7901细胞的抑制作用（略） 2.2槲皮素诱导SGC7901细胞的凋亡处理48h后,SGC7901细胞呈现典型的凋亡改变.流式细胞仪检测显示,槲皮素（40μmol/L）组细胞早期凋亡率为61.93％,阳性对照组早期凋亡率为62.80％,均明显高于阴性对照组,差异有统计学意义(P均=0.000). 2.3RealTimeRT?PCR检测SGC7901细胞stat3,survivinmRNA的
8、表达胃癌SGC7901细胞株高表达stat3mRNA和survivinmRNA（图2）.槲皮素（40μmol/L）作用细胞48h后,stat3和survivin的mRNA表达均明显下调,与阴性对照组相比差异有统计学意义（P=0.029，P=0.020）.阳性对照组也有相似表现，差异有统计学意义（P=0.
