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1、基因扫描微卫星DNA进行常染色体显性遗传性多囊肾病囊肿前诊断-->[摘要]目的:利用与多囊肾病PKD1基因紧密连锁的微卫星DNA,通过家系连锁分析,进行常染色体显性遗传性多囊肾病(ADPKD)的囊肿前诊断,为临床分子诊断奠定基础。方法:采用PCR-基因扫描的方法,对4个ADPKD家系共39人进行连锁分析。结果:通过连锁分析,发现4个家系中1名16岁个体为PKD1突变携带者,处于囊肿发生前期。结论:基因扫描微卫星DNA是一种快速、准确的基因分型方法,可用于ADPKD的囊肿前诊断。常染色体显性遗传性多囊肾病(autosomaldomi-nantpolycy
2、stickidneydisease,ADPKD)是一种常见的遗传性肾病,是导致肾功能衰竭的主要病因之一,发病率约为1/1000~1/600[1]。临床上,该病累及多个系统,至60岁时约50%患者将发展为肾功能衰竭,需透析或肾移植治疗。而且该病多在40岁左右发病,此时已将致病基因遗传给子代,造成该病的延续发生,严重危害了人类健康。从20世纪80年代中期,国外就开始利用各种方法对多囊肾病进行早期诊断(囊肿前诊断和产前诊断),以利于早期防治,延缓或控制疾病的发生和发展[2]。20世纪90年代以来,利用微卫星DNA通过连锁分析进行多囊肾病的分子诊断,在分析中多
3、采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行基因分型[3],无法进行大规模、自动化检测,且多局限于实验研究阶段,难以实现临床常规分子诊断。为在临床广泛实施早期诊断,我们利用新近发展起来的基因扫描方法分析了与PKD1紧密连锁的微卫星DNA的多态性[4],并进行了多囊肾病的分子诊断。1材料和方法1.1研究对象从长征医院多囊肾病专病门诊明确诊断的志愿ADPKD患者中,挑选出4个家系作为研究对象,共39人,患者15例,其中肾功能衰竭患者4例。ADPKD家系入选标准:具有ADPKD家族史,有2代以上的患者,每代中至少有2例患者和2名正常人。所有入选患者均经B超或CT检查证实有多囊
4、肾,年龄21~67岁,男女比例为7∶8。4例肾功能衰竭患者发生终末期肾病的年龄均小于60岁,目前进行血液透析治疗。1.2基因组DNA的抽提采用常规的蛋白酶K,酚∶氯仿∶异戊醇法提取外周血白细胞基因组DNA,TE溶解,用紫外分光光度计检测DNA的浓度及纯度,-20℃保存备用。1.3微卫星DNA扩增引物的设计合成选取与PKD1基因紧密连锁的3个微卫星位点SM6、C7进行连锁分析[3],3个位点与PKD1的相对位置见图1。设计合成3个位点的扩增引物,利用不同的荧光染料标记引物,引物序列如表1所示。1.4PCR扩增微卫星DNAPCR扩增体系如下:反应体积为25
5、μl,ExTaq酶1U,MgCl21.5mmol/L,250μmol/L4×dNTP,DNA模板50ng,引物各8pmol,1×PCR缓冲液。扩增在Gradi-entcyclerPTC-200扩增仪上进行,扩增条件为:95℃预变性5min;94℃变性1min,55~60℃退火1min,72℃延伸1min,共32个循环;72℃延伸5min。反应产物4℃保存。本论文由.51lunentlengthpolymorphism,RFLP)和微卫星DNA(microsatelliteDNA)。由于微卫星DNA的多态信息含量更高,微卫星DNA就逐渐替代了RFLP,成
6、为目前应用最广泛的遗传标记[3]。微卫星DNA在基因组中广泛存在,是以2~7个碱基为核心单位串联重复而成的一类序列,又称为短串联重复序列(shorttandemrepeats,STR)。由于核心序列重复数目的变化而在群体中呈现出遗传多态性,但在同一家系内具有高度的遗传保守性,以孟德尔方式遗传。这种结构最常见的是二核苷酸重复,其次是三、四核苷酸重复,目前用于ADPKD连锁分析的STR均为(CA)n重复。通过PCR扩增STR序列,检测扩增片段的大小和基因分型,进行连锁分析,可作出基因诊断(囊肿前和产前诊断)。本实验应用与PKD1紧密连锁的STR对4个ADP
7、KD家系进行连锁分析和囊肿前诊断,确定4个家系均与PKD1连锁,为1型多囊肾病家系,1家系中1名16岁尚未发病的个体为PKD1突变携带者,处于囊肿发生前期。既往STR的片段大小和基因分型多采用非变性聚丙烯酰本论文由.51lunwen.整理提供胺凝胶电泳检测,易受电压、电泳胶和实验者等因素影响,出现实验误差。为避免上述因素的影响,本实验采用了目前公认的准确性较高的微卫星DNA检测方法——基因扫描微卫星位点进行基因分型,提高了实验的可靠性和准确率。本实验结果表明基因扫描微卫星DNA进行ADPKD囊肿前诊断是可行的,此实验的成功为临床开展大规模的ADPKD基
8、因诊断奠定了基础。[-->9-996.[2]张维莉,易建中,梅长林.常染色体显性遗传性多囊肾病
