探讨pten和vegf165基因mrna表达在卵巢癌发生和演进中的作用

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1、探讨PTEN和VEGF165基因mRNA表达在卵巢癌发生和演进中的作用-->【摘要】　目的:探讨PTEN和VEGF165基因mRNA表达在卵巢癌发生和演进中的作用。方法:利用RT-PCR方法检测正常卵巢(n=5)、卵巢囊肿(n=5)、卵巢交界性肿瘤(n=9)、上皮性卵巢癌(n=60)和卵巢癌细胞系CAOV-3中PTEN和VEGF165基因mRNA表达。结果:PTEN基因mRNA在卵巢交界性肿瘤和卵巢癌中的表达水平低于正常卵巢和卵巢囊肿,P【关键词】　卵巢肿瘤;PTEN基因;mRNA表达;VEGF基因　　PTEN/MMAC1/TEP1是迄今为止发现的第一个具有磷酸

2、酶活性的抑癌基因,其编码蛋白既具蛋白磷酸酶活性,使磷酸丝氨酸/苏氨酸和磷酸酪氨酸残基脱磷酸化,负性调节细胞的运动、浸润和转移[1];又具有脂质磷酸酶活性,作用于酸性底物磷脂酰肌醇-3•4•5-三磷酸(PIP3),抑制依赖PIP3激活的丝/苏氨酸激酶PKB/Akt活性,从而诱导周期素依赖性激酶(CDK)抑制剂P27活性[2]。血管内皮生长因子(VEGF165)可促使内皮细胞生长、增殖,是内皮细胞特异的强效有丝分裂原;同时VEGF165还可增加血管通透性,使血浆蛋白外渗,形成血管生成的临时基质,有利于血管生成[3]。最近有文献报道野生型PTE

3、N可以下调细胞中VEGF165表达,进而抑制新生血管形成[4]。本研究检测了正常卵巢、卵巢囊肿、卵巢交界性肿瘤和卵巢癌中PTEN和VEGF165基因mRNA表达,探讨其与卵巢癌临床病理特征的关系,并分析两者表达的相关性。1　材料与方法1.1研究对象及样品正常上皮卵巢组织(n=5)、卵巢囊肿(n=5)、卵巢交界性肿瘤(n=9)和上皮性卵巢癌(n=60)组织标本收自于中国医科大学附属第一医院、附属第二医院和沈阳市妇婴医院2000-2002年住院接受手术患者,年龄17~68岁,中位年龄54岁,术前均未接受放化疗。术中切取卵巢部分组织立即置液氮中速冻30min后,移入-

4、70℃冰箱中保存,用于提取mRNA。部分组织用4%甲醛固定,石蜡包埋,4μm厚切片,HE染色后用于病理诊断。CAOV-3卵巢癌细胞系,购置美国ATCC。用加10%FCS的DMEM培养液于37℃、5%CO2条件下培养。利用TRIZOL试剂(GibcoBRL,Gaitjhersburg,Md.USA)从冰冻标本和细胞系中提取RNA。1.2方法应用RT-PCR,采用Takara公司的AMV逆转录酶将1μL总mRNA反转录成cDNA,β-actin作定量对照。将它们的cDNA产物进行PCR扩增(TechneIncorporat-ed,Duxford,Cambridge)

5、。PTEN基因的正向引物为5′-CATACCAGGACCAGAGGAAACC-3′;反向引物5-′TG-GATCAGAGTCAGTGGTGTCAG-3′(209nt);β-actin正向引物5-′ACACTGTGCCCATCTACGAGG-3′;反向引物5-′CTTTGDGGATGTCCACGTC-3′(381nt)。VEGF165正向引物为5′-GCCCACTGAGGAGTCCAACA-3′反向引物为5′-CCGCCTCGGCTTGTCAC-3′(289nt),将总量12μL的PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(8%分离胶和3%浓缩胶),银染显带。应用Che

6、miImage5500自动电泳凝胶成像分析仪分别测定PTEN和VEGF165与β-actin扩增带平均灰度值(A),分别计算PTEN和VEGF165基因mRNA表达指数(Ⅰ),IPTEN=APTEN/Aβ-actin,Ivegf=Avegf/Aβ-actin。1.3统计学分析采用方差分析区分不同组的均值,采用Pearson分析研究数据的相关性,利用直线回归分析判断指标的因果关系。P2.2　PTEN和VEGF165基因mRNA表达与卵巢癌临床病理特征的关系PTEN基因mRNA表达水平与卵巢癌临床病理分期呈负相关,P2.3　PTEN和VEGF165基因mRNA表达的

7、关系正常卵巢和卵巢病变组织中PTEN和VEGF165基因mRNA表达呈负相关,P=0•000,Pearson’R=-0•725,VEGF165基因mRNA表达随PTEN基因mR-NA表达降低而升高,r=0•728,P=0•000,直线回归方程为:IVEGF165=1•549-1•518×IPTEN(图2)。3讨论肿瘤抑制基因PTEN在细胞凋亡、迁移和肿瘤演进中发挥作用[5]。目前,研究发现PTEN通过突变、杂合性缺失(LOH)、过甲基化、微卫星不稳定或转-->录抑制等遗传学改变,导致PTEN

8、基因表达“沉默”[4]。