单核苷酸多态性及其应用

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1、单核苷酸多态性及其应用SNP的概念单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism,SNP)是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸的突变而引起的多态性。同一物种不同个体间染色体上遗传密码单个碱基的变化，主要表现为基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性。SinglenucleotidepolymorphismSNP的特征SNP是人类可遗传的变异中最常出现的一种，占所有已知多态性的90%以上，在人类基因组中广泛存在，人类DNA中每300-1000bp就有一个SNP.因此，一个人类个体大约携带300万-1000万个SNPs

2、。SNP的特征一个SNP表示在基因组某个位点上一个核苷酸的变化，作为一种碱基的替换，大多数为转换（C—T，G—A），也可能是颠换。具有转换型变异的SNP约占SNP总量的2／3左右。转换的发生率总是明显高于其它几种变异，而且在CG序列上出现最为频繁，多是发生C—T的转换，原因是CG中的C是甲基化的，它能自发的脱氨基而替换为胸腺嘧啶。SNP大都表现为二等位基因（bialletic)多态性,即在该位置只存在两种不同的碱基。位于染色体上某一区域的一组相关联的SNP等位位点被称作单倍型(haplotype)，相邻SNPs的等位位点倾向于以一个整体遗传给后代

3、.根据SNP在基因组中的分布位置可分为:基因编码区SNP(cSNP)基因调控区SNP(pSNP)基因间随机编码区SNP(rSNP)等三类。因为编码区内的变异率占周围序列的1/5，cRNP的总量显著少于其他两类SNPs。cSNP又可分为2种：同义cSNP(synonymouscSNP)：非同义cSNP(non-synonymouscSNP)同义cSNP：SNP所导致的编码序列改变并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的含义相同；非同义cSNP：指碱基序列的改变可使以其为蓝本翻译的蛋白质序列发生改变，从而影响蛋白质的功能。这种改变

4、常常是导致生物性状改变的直接原因。位于基因调控区的SNP则会影响基因表达量的多少，因此，这两类SNP在功能和疾病发生发展方面具有更重要的意义。SNP的检测方法单链构象多态性(single-strandconformationalpolymorphism,SSCP)原理：单链DNA的折叠结构是由单核苷酸序列决定的，当某一个碱基发生突变时，便会直接影响该链的构象，非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时迁移率会发生改变。SNP的检测方法变性梯度凝胶电泳（denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE)原理:当双链DNA在变性梯度

5、凝胶中进行到与DNA变性温度一致的凝胶位置时，DNA发生部分解链，电泳迁移率下降，DNA链中有一个碱基改变时，会在不同的时间发生解链，因影响电泳速度变化的程度而被分离。SNP的检测方法Taqman法以荧光共振能量传递(fluorescentresonanceenergytransfer,FRET)为基础的检测方法。在PCR反应中，将供者-受者染料对分别结合到Taqman探针的两端，探针未与目标序列结合时，通过FRET作用使供者不发荧光；完全互补配对后，由于TaqDNA聚合酶具有5‘核酸酶的活性，可将供者从探针上切下来从而发出荧光。如果探针与目标序

6、列中存在错配碱基，就会减少探针与目标序列结合的紧密程度及TaqDNA聚合酶切割供者的活性，也就影响了供者的荧光释放量，从而使碱基突变链和正常链得以区分。供者受者5‘3‘Taqman探针供者受者5‘3‘Taqman探针供者受者5‘3‘引物目标序列受者5‘3‘引物供者目标序列SNP的检测方法分子信标(molecularbeacon)法分子信标是一个U型的单链核苷酸探针（探针序列内部可有一定程度的互补配对），在探针两端也加上供者-受者染料对，U型探针使两染料靠近，通过FRET作用使供者不发荧光。当探针与目标序列完全互补配对后，两染料分离，使得供者的荧光

7、亮增加，如果目标序列中存在错配碱基，就会影响探针与其结合，从而影响到供者的荧光亮，使碱基突变链和正常链得以区分。供者受者供者受者焦磷酸测序法焦磷酸测序法(pyrosequencing)是一种不依赖平板胶或毛细管电泳，不依赖DNA的荧光标记/激发/检测体系的序列分析技术，适用于已知序列的DNA片段进行验证分析，适用于已知SNP的序列验证及基因分型。焦磷酸测序法主要是由四种酶催化同一反应体系中的酶级联反应:包括DNA聚合酶、硫酸化酶、萤光素酶和双磷酸酶;反应底物为adenosine5‘phosphosulfate(APS)和萤光素。反应体系还包括待测

8、序的DNA单链和测序引物。在每一轮测序反应中，加入一种dNTP。如该dNTP与模板配对，聚合酶就可以催化该dNTP掺入到引物链中并释放焦