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1、猫爪草多糖体外抗乳腺癌作用研究陶立君（浙江省嘉兴第二医院浙江嘉兴314000）【摘要】目的：研究猫爪草多糖的体外抗乳腺癌活性。方法：选取了多糖提取物的不同浓度，采用MTT法和流式细胞术考察其对人乳腺癌细胞株MCF-7的抑制作用和细胞凋亡。结果：猫爪草多糖对人乳腺癌MCF-7细胞株的生长有不同程度的影响，与空白对照组比较差异有显著性；流式细胞术显示其能诱导细胞凋亡；另外，还能增强NK细胞活性。结论：猫爪草多糖具有较好的体外抗乳腺癌活性。【关键词】猫爪草；多糖；MCF-7【中图分类号】R73-3【文献标识码】A【文章编号】1007-8231（2016）03-0028-02独爪草Radix
2、ranunculusternati系毛茛科植物小毛莨RanunculusternatusThunb.的干燥块根［1］，别名为三散草（浙江｝、猫爪儿草（河南）、猫爪子（河南）、鸭脚板（安徽）、金平草（广丙）［2］,原主产于我国河南信阳地区的信阳、横川、息县及驻马店地区的正阳、确山，现长江中、下游各省，浙江、江苏、安徽、江丙、台湾、广丙、河南、湖北、湖南、四川、云南、贵州等地均有分布［3-5］。猫爪草的化学成分非常复杂，中国医学科学院药物所测定，猫爪草含糖16%、油1.2%、植物碱很少［6］;U木学者从其变种Rnaunuclusternatusvar.glaber的地上部分分离鉴定出葡萄
3、糖、阿拉伯糖及半乳糖等单糖成分［7-8］。经多年临床验证,猫爪草对恶性淋巴瘤、甲状腺瘤和乳腺肿瘤等只有较好的效果［9-10］,但有关猫爪草抗肿瘤的有效成分及作用机制尚不清楚。鉴于猫爪草入药常以水煎煮用之，且经初步预试，猫爪草中多糖含量较高。为此木实验对猫爪草多糖进行提取，研究其对体外培养人乳腺癌细胞株MCF-7的作用，以寻找猫爪草抗肿瘤的有效部位及作用机理，为临床治疗肿瘤提供理论依据。1.实验材料1.1药品与试剂猫爪草（本校药学院提供，产地河南信阳,经鉴定为毛苡科植物小毛茛的干燥块根）；RPMII640培养基（GIBCOBRL公司产品）；MTT（Sigma公司）；氟脲嘧啶（江苏恒瑞医
4、药股份有限公司）；葡萄糖对照品和其它相关试剂均为分析纯。1.2主要仪器AE31型倒置相差显微镜（Motic公司）；超净工作台SW-CI-IF型（苏州净化设备厂）；全自动酶标仪（Mod550型，美国BioRad公司）；低温冷冻离心机（Eppendorf,德国）；电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）;血球计数板（上海求精生化仪器厂）。1.3人乳腺癌细胞株MCF-7本院药理教研室提供1.实验方法2.1猫爪草多糖的提取纯化采用水提醇沉和svega法［11］提取和纯化多糖精密称取晾干的猫爪草粉末100g,置入索氏提取器中,依次用石汕醚（30°C〜60°C）,乙醚和乙醇冋流提取4小吋，残渣挥
5、干溶剂后，再以水冋流提取4小吋,减压浓缩至一半体积，加入0.1%活性炭，脱色、过滤，滤液加入95%乙醇使溶液含醇80%,静置过液、过滤，残渣用乙醚、无水乙醇反复洗涤，得猫爪草粗多糖，加水溶解成10%糖溶液，svega法脱蛋白，水溶液低温冷冻干燥得猫爪草总多糖备用。2.2猫爪草多糖对人乳腺癌细胞株MCF-7增殖的抑制效应取对数生长期MCF-7接种于96孔板，每孔5×103个细胞，过夜培养，加入皂苷、配成质量浓度分别为12.5、25.0、,50.0、100、200、400mg/L,每一浓度设3个平行孔，另设空白对照组、5-Fu组（50mg?L-l）。培养48h。加入5g/L的
6、MTT,再培养4h。倒尽培养液,各孔加150μLDMSO,轻轻振动后，用酶标仪（波长570nm）测定各孔的光密度（0D）值，取每组平均0D值，绘制量-效曲线，计算细胞生长抑制率。抑制率（％）=（1-加药孔平均0D值/对照孔平均0D值）×100%。2.3流式细胞术（FCM）猫爪草多糖（500mg/L）作用MCF-7细胞72h后，收集细胞,PBS反复洗涤、离心。75%乙醇,4'C固定过夜。加200μLRNA酶溶液（5g/L>,37°C,30min,冰浴终止细胞悬液加PI（50mg/L）染色,4°C,30min,FCM（波长488nm）测定细胞周期。2.4自然杀伤（
7、NK）细胞活性测定脾细胞体积分数为l×107/mL,靶细胞MCF-7分积分数为5×105/mL,效-靶为20:1,效砬、靶细胞各取100μL,自然释放组以培养液代替效应细胞,最大释放组以1%NP40代替效砬细胞,37°C孵育2h后终止效靶反应,1500r/min离心5min,取上清每孔100μL于96孔板中,37°C预热,加入底物液每孔100μL,室温静置lOmin,加入O.lmol/L柠檬酸30μL,终止酶
