成骨细胞线粒体caspase-3、caspase-9、bcl-2蛋白对骨质疏松症发病机理研究的影响

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1、成骨细胞线粒体Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2蛋白对骨质疏松症发病机理研宄的影响(1.广州医科大学附属第一医院老年病科510120；2.广东省屮西医结合医院骨科528200)【摘要】目的：探讨Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2蛋白对骨质疏松症发病机理的影响。方法：收集20例患者(骨质疏松症组、正常组各10例)髋关节置换手术屮取下股骨头或股骨颈屮松质骨，分别进行成骨细胞体外培养，通过EUSA方法检测正常人和骨质疏松症患者成骨细胞屮Caspase-3、Caspase-9,Bcl-2蛋闩表达情况。结果：对比于正常组，骨质疏松症组屮Caspase-3、Caspas

2、e-9的表达较正常组增高，差异有统计学意义(P<0.05),而Bcl-2表达水平在骨质疏松症组屮较正常组下降，差异亦有统计学意义(P<0.05)。结论：在骨质疏松症的成骨细胞凋亡过程屮，Caspase依赖性凋亡途径激活，而Bcl-2途径受到抑制。【关键词】骨质疏松症;成骨细胞;Caspase-3；Caspase-9；Bcl-2【屮图分类号】R2【文献标号】A【文章编号】2095-7165(2015)18-010-02骨质疏松症是以一种由于骨强度降低而使骨折风险升高的全身性骨骼疾病［1］,是屮老年人的一种常见病、多发病。据统计，至2008年止，我国有骨质疏松症患者约为6944万，

3、随着人口不断老龄化，50岁以上人群低骨量和骨质疏松症的患病率还会增加［2］。成骨细胞屮的Caspase家族蛋白、线粒体色素C、线粒体膜间隙蛋Q等共同参与Y成骨细胞的凋亡过程。我们通过构建两种体系的成骨细胞蛋內质表达谱，比较正常人和骨质疏松症患者蛋白质表达谱的差异，挖掘出两者不同的特征蛋內标志物，藉此探讨骨质疏松症的发病机理，为骨质疏松症的病情分级提供合理的客观量化依据。1研究方法1.1标本的收集病例来源：广州医科大学附属第一医院骨科标本收集的部位：来自髋关节置换手术中取下股骨头或股骨颈中松质骨。1.2骨质疏松症患者松质骨的收集1.2.1纳入标准①女性在绝经1年以上，年龄50-55岁；②经骨

4、密度检查诊断为骨质疏松症者；③能够收集到较为齐全的相关资料者；④均签订知情同意书。1.2.2排除标准继发性骨质疏松症患者；6个月内服用过影响骨代谢药物的患者；合并其他疾病的患者；不同意和配合进行研究的患者。1.3正常成人松质骨的收集1.3.1纳入标准①女性在绝经1年以上，年龄50-55岁；②能够收集到较为齐全的相关资料者；③均签订知情同意书。1.3.2排除标准6个月内服用过影响骨代谢药物的患者；合并其他疾病的患者；不同意和配合进行研宄的患者。1.4病例分组选择符合上述各项标准患者分为骨质疏松症组、正常组，每组10例。研宄前需同患者签定知情同意书，严格控制各组年龄及绝经吋间，以达到组间均衡，

5、使之在统计学上无差别意义。1.5成骨细胞的培养及增殖凋亡检测将松质骨剪成2mm×2碎片，Hank’s反复冲洗至骨片变白，用胰蛋白酶消化骨片，前3次将消化的上清弃掉，自第4次收集上清进行离心，用10%胎牛血清和DMEM培养液将沉淀物吹打均匀，滤过后接种于25cm2培养瓶内，每3天更换培养液至细胞融合备用，液氮冻存备用。采用四甲基偶氮唑盐法对成骨细胞增殖进行检测，在波长490nm处于酶标仪上测定光度值。对各组细胞用流式细胞仪在488nm波长氩离子激光下以Elite软件分析细胞凋亡率。1.6线粒体的提取及蛋白质的测定采用细胞匀浆法对细胞进行分离线粒体：使细胞生长铺满整个培

6、养表面,分别加入PBS缓冲溶液到每个细胞培养瓶，覆盖培养瓶表面，然后抽去，再加入胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满整个培养平面，然后置入37°C培养箱，经离心、涡旋震荡，移出上清液后，保留沉淀颗粒以获得线粒体沉淀物，再•重复上述步骤，以获得高纯线粒体样品，最后置于-70°C冰箱保存备用。将线粒体沉淀，加入适量裂解液，室温放置巧分钟，其间不断涡旋搅动，12000rpm离心弃去不溶物，吸取上清液，即为蛋白质样品溶液。蛋白质的测定采用ELISA法测定。2实验结果2.1骨质疏松症组与正常组基本特征情况见表1骨质疏松症组年龄(51.9000±1.7920)与正常组年龄(52.0000&p

7、lusmn;1.4142)两独立样本资料T检验,P>0.05,差异无统计学意义。骨质疏松症组绝经吋间(2.2300±1.1036)与对照组绝经时间(2.2500±1.0865)两样本资料T检验，P>0.05,差异无统计学意义。两组组间基线特征均衡，骨质疏松症组与正常组具有可比性。另外，通过171丁丁法测定细胞活性，结果显示骨质疏松症组细胞活性降低，与正常空白组差异明显(P<0