生物药物分析第二章酶法分析

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1、第二章酶法分析第一节概述基本原理：利用酶的特点，以酶作为分析工具或分析试剂，用于测定生物药物样品中用一般化学方法难于俭测的物质，如底物、辅酶、抑制剂和激动剂(活化剂)或辅助因子含量的方法酶法分析与酶活力测定的异同相同点：二者均使用了酶促反应不同点：测定的目的物不同，实验设计不同1）酶活力测定中待测物为酶，因而酶必须是限速因素，而底物和辅酶等必须过量2）酶法分析中待测物不是酶，而是底物或辅酶或抑制剂或激动剂等等。因而必须使待测物成为该反应的限速因素一、终点法(总变量法)先借助酶反应（单个酶反应或者几种酶构成的偶联酶反应）使被测物质定量地进行

2、转变，然后在转变完成后，测定底物、产物或辅酶物质（第二底物）等的变化量终点法是酶法分析中最普遍，最广泛的定量法1、终点法的条件必须有专一地作用该被测物质的酶，并能得到它的制品能够确定使这种酶反应接近进行完全的条反应中底物的减少或产物的增加或辅酶物质的改变等可以借助某种简单的方法进行测在能满足这些条件的情况下，最好是采用单一酶反应就能进行定量检测2、使用终点法应注意的问题酶的底物专一性1）绝对专一性2）相对专一性3）立体异构专一性对于酶法分析来说，最理想的酶是具有绝对专一性酶3、反应的平衡酶反应平衡十分偏向进行方向，不需进行任何处理若反应的

3、平衡并不十分偏向进行方向，或偏向逆方向，通常需采取以下一些措施：对于双底物反应尽可能提高第二底物的浓度对氧化还原之类与H＋有关的反应要选择适当的pH设法除去产物用具有不同平衡常数的辅酶类似物代替原有的辅酶和第二底物的再生系统偶联，则第一底物可能完全转化为反应产物4、反应液中的酶量对于单酶反应的酶法分析：所加入的酶量（u/ml）相当于Km（mmol）对于偶联反应的酶法分析，所加入酶量如下：1）第一反应为酶量（u/ml）相当于Km1（mmol）2）第二反应为酶量（u/ml）相当于（1～2）×Km2（mmol）5、反应产物抑制酶促反应的产物对该

4、反应存在抑制作用，应采取去除该产物或用再生系统偶联的办法加以解决反应速度法下列情况使用反应速度法：1）很难得到专一地作用并定量转化被测物质的酶或偶联指示酶时2）被测物及其微量时使用速度法可对S、抑制剂、激动剂、辅酶等定量一、终点法的种类（一）单酶反应定量法：在单酶反应中，不需指示反应，可以直接测定S减少量或P增加量和辅酶变化量第二节、酶法分析的类型与操作步骤1、底物减少量的测定可定量的物质有：胞嘧啶（280nm）、腺嘌呤（280nm）和尿酸（293nm或297nm）2、产物增加量的测定在以待测物为底物的酶反应中，底物被转变为具有可进行专一

5、性定量测定的性质产物此法可定量的物质有（293nm）：1）各种氨基酸和草酸2）黄嘌呤、次黄嘌呤以及CoA3、辅酶变化量的测定条件：测定以NAD或NADP为辅酶的脱氢酶的底物的量，此法适用范围很广原理：NADH和NADPH在340nm有特征最大吸收峰，而NAD和NADP在340nm无吸收带，故可应用于NAD或NADP为辅酶脱氢酶反应，通过测定340nm吸光度变化，对作用相应脱氢酶底物的物质进行定量分析羟基丙酮酸定量L-谷氨酸定量（二）和指示酶反应偶联的定量法常用在下面两种情况1、以脱氢酶为指示剂葡萄糖-1-磷酸（G-1-P）的定量2、以脱氢

6、酶以外的酶作为指示剂过氧化物酶作为指示剂心肌黄酶作为指示剂492nm有强吸收L-谷氨酸的定量测定：测定反应：L-Glu+NAD+H2O谷氨酸脱氢酶+α-酮戊二酸+NADH+H+指示反应：NADH+INT+H心肌黄酶NAD+甲臜++NADH+H+INT(碘代硝基四唑)NAD+甲臜心肌黄酶+二、反应速度法根据酶在一定pH和温度条件下催化底物（待测物）反应初速度在酶反应中除待测物（底物）外，影响反应速度的其他物质均过量，反应速度则与待测物浓度成正比关系当待测物作为某种酶专一辅酶或抑制剂时，则该物质浓度和酶反应速度之间存在一定关系1、辅酶的测定S

7、EP抑制剂抑制剂的量与反应速度的下降值成正比例：肝素的测定RNA小分子RNAse肝素紫外有吸收无肝素量与反应速度的下降值（V=ΔA/Δt）成正比2、抑制剂的测定标准曲线法标准曲线样品的测定管号01234512标准肝素溶液（ml）00.20.40.60.81.0待测样品(ml)1.01.0H2O(ml)21.81.61.41.21.01.01.0RNA(ml)11111111RNAse(ml)11111111连续测定各管A300值，求出各管ΔA300=0.04所需的时间ΔtΔt0Δt1Δt2Δt3Δt4Δt5Δt测1Δt测2肝素含量标准曲线

8、根据Δt测/Δt0计算样品中肝素含量三、酶循环放大分析法基本原理：利用酶循环和酶对底物特异性来放大靶物质（被测物）的测定方法此法仅循环靶物质，减少了样品中存在的其它物质对测定的干扰，不需要对样