直接获取生物组织内部磷脂类物质的质谱分析方

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时间:2018-10-25

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1、直接获取生物组织内部磷脂类物质的质谱分析方1引言磷脂类物质及其代谢物具有重要的生理功能,在细胞生长分化、凋亡吞噬、能量储存、信号传递等生理过程起到重要作用。磷脂作为细胞膜的主要组成成分,在细胞中的含量相对较高,是单细胞领域研究备受关注的物质之一。由于很多疾病的发生、发展都与体内磷脂类物质含量的变化、代谢紊乱等密切相关,可作为一些疾病的生物标记物。因此,尽可能全面地得到生物组织样品中磷脂类物质信息’对揭示其在生命体内的作用机制、寻找疾病的分子标志物及医药研发等方面具有重要意义。然而,由于磷脂类物质种类繁多,相互作用复杂,传统的分析技术检测复杂样品(如血浆、组织)中磷脂类物质时,一般都要经过

2、分离、纯化、提取等复杂的样品预处理过程不仅耗时较长,而且可能带来不确定因素。直接质谱分析技术,如电喷雾解吸电离(DESI)、激光消融电喷雾电离(LAE-SI)等,因其无需样品预处理、样品耗量少、响应速度快、灵敏度高等,可实现生物组织样品中多种磷脂类物质的同时、直接、快速识别。这些方法主要分析组织样品表面的磷脂,无法实现对整体组织样品内部磷脂的直接检测。内部萃取电喷雾电离质谱(iEESI-MS)技术直接将萃取剂导人到组织样品内部’可实现组织样品内部小分子代谢产物等组分的直接质谱分析。本研究采用iEESI-MS技术,在无需样品预处理的条件下,考察了21种不同组成的CH3OH-H2O溶剂体系,

3、获得。%0仏%0(30:70,V/V)为适合不同生物组织样品中磷脂类物质分析的最佳溶剂’建立了一种无需破坏、研磨即可获取生物组织样品内部磷脂类物质的质谱学新方法。2实验部分2.1仪器与试剂内部萃取电喷雾电离源(iEESI)为本实验室自制;LTQ-XL线性离子阱质谱仪并配有Xcalibur数据处理系统(美国ThermoScientific公司);质谱仪设置在正离子检测模式下,质量扫描范围为m/z50~2000,离子源电压5.5kV,离子传输管温度为150T,毛细管电压为10V,透镜电压为100V;在进行串联质谱分析时,设置碰撞能量为10?30%,碰撞时间为30ms,母离子隔离宽度为1.5D

4、a;其它检测参数由LTQ-Tune系统自动优化得到。石英毛细管(内径0.10mm,外径0.19mm,美国AgilentTech?nologies公司);甲醇(色谱纯,美国ROE公司),实验用水为二次蒸馏水。2.2实验方法iEESI-MS的实施方式如图1所示。将石英毛细管平行插人组织样品内部,插人组织样品内部的石英毛细管前端距离样品前沿约2mm,样品前端与质谱人口的距离为5?6mm,萃取溶剂以0.5/min的流速通过石英毛细管,流经组织样品内部并在组织样品内部进行选择性萃取。在微量进样针的钢针部位施加5.5kV正高压,在电场的作用下,样品前端产生大量承载待测物的微小带电液滴。这些微小带电液

5、滴去溶剂化后得到气态待测物离子,引人质谱仪检测。本研究所用实验样品人体肺癌组织(包括癌意图症组织与癌旁组织(距离癌症组织中心约5cm))Fig.1SchematicdiagramofinternalextractiveelectrosPray和食管癌组织由南昌大学第二附属医院提供,其iTOiZatiTO(iEESI)maSSSpectr0metry它组织样品,如猪肺、猪肉、牛肉、猪心等,购自当地市场。所有样品均储存于-80°C超低温冰箱中,在进行iEESI-MS分析前,将样品取出室温下解冻,样品无需其它处理,即可直接进行iEESI-MS实验。在优化实验中,以不同体积比的CH3OH-H2O

6、萃取每种样品,平行检测至少3次,确保实验结果的重复性。3结果与讨论3.1萃取溶剂优化为了全面获取组织样品中磷脂类物质信息,选择合适的萃取溶剂对提高分析方法的性能具有重要意义。目前,最常用的脂类物质萃取方法是传统的“金标准”法,即Folchorblighanddyerrecipes法。该C+Na]+)、m/z809([DOPC+Na]+)和m/z833([SAPC+Na]+)这3种磷脂类物质的信号强度基本都逐渐增大;当CH3OH含量在35%时,这4种磷脂类物质的信号强度明显下降;当CH#H含量在40%?70%范围时,这4种磷脂类物质的信号强度不再随CH3OH含量的增大发生明显的变化;当CH

7、3OH含量达到75%时,这4种物质的信号强度又开始增大。但总体来说,CH,OH含量为30%时,这4种磷脂类物质的信号强度最高;当CH,OH含量大于75%后c)的iEESI-MS化学指纹谱图。通过进行碰撞诱导解离实验(CID)和相关文献比较证实,这3种组织样品在m/z700-900质量范围内主要得到磷脂类物质,如m/z757[PC(32:0)+Na]+,m/z773[PC(32:0)+K]+,m/z783[PC(36:4)+Na]+,

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