蛋白质的生物质谱分析

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1、复旦大学硕士学位论文蛋白质的生物质谱分析姓名：卞利萍申请学位级别：硕士专业：分析化学指导教师：杨芃原2001.5.25●摘要蛋白质的生物质谱分析蛋白质的生物质谱分析摘要ff自从90年代初，电喷雾、基质辅助激光解析等新型的离子化技术出现后，用质谱分析鉴定大分子蛋白质成为常规分析手段。相比传统的蛋白质分析技术，质谱以其快速、灵敏、提供信息丰富等特点，成为生物学和化学工作者的有力工具。质谱能够精确地测定蛋白质等大分子的分子量，因此可以快速、有效地鉴定基因表达的蛋白质，与HPLC、CE、分离芯片等联用后，可

2、以推测蛋白质的～级结构，并发现基因在表达过程中的修饰和变异。随着人类基因组测序的基本完成，蛋白质组学成为新的研究热点。生物质谱技术以其独有的优势又成为蛋白质组学研究中的核心技术。目前，用二维凝胶电泳和质谱开展功能蛋白质组的研究，对发现致病基因、新药开发具有指导性作用；从发展前景上看，质谱可以大规模、高效率、高准确性地鉴定一个组织或细胞中的全部蛋白质，对于在细胞和生命有机体的整体水平上认识生命现象的本质和活动规律具有深远的意义。目前，用生物质谱分析鉴定蛋白质的方法学仍在不断发展，发展有效的联用技术，样

3、品的前处理，谱图中大量有用信息的提取和解析，数据库搜索方法的优化和改进，对最后快速、有效地鉴定蛋白质部具有重要的作用。对新兴的蛋白质组学来说，研究体系更为复杂，极微量蛋白的有效分离、提取和鉴定方法都还没有很成熟的规律，都是难点ij趣和关键技术。对上述问题进行探索性研究，具有深刻的学术与应用意义。矿本论文主要发展了前人创立的用电喷雾质谱分析鉴定蛋白质的标准方法；在蛋白质组学研究中，创建了鉴定胶上染色斑点的标准方法，并应用于二维凝胶电泳分离后胶上实际斑点的鉴定。在此过程中，研究和讨论了样品前处理技术，证

4、明样品脱盐和去除表面活性剂的必要性，并在以后的分析实践中使用最有效的HPLC--MS联用技术进行在线的前处理、分离和检测。I在微柱HPLC一质谱联用技术方面，优化了各种仪器条件，进一步提高了质谱的检测灵敏度，减少了柱后扩散效应，并得到断裂更完全、可推测序列更长的CID谱图。在蛋白质组学的蛋白鉴定方面，建立了～套胶上酶解、肽段提取、微柱HPLC—MS联用分析、数据库搜索的有效方法。在胶上极微量蛋白点的检测方面，有效地应用自填毛细管柱和质谱联用，初步分析了胶上极微量的结核杆菌分泌蛋白点。1／在复杂的CI

5、D谱图解析方面，综合应用并讨论了Derlovo测序方法和本实验室发展的序列模式相关的测序方法，有效地应用于谱图解析和数据库搜索。在数据库搜索方面，成功地应用并讨论了多种数据库搜索方法，如肽质量指纹搜索，用解谱后的序列搜索，序列标签搜索，并发展了一种更为有效的数据库搜索方法，即使用MAscOT搜索平台，不用解谱，直接将多组CID谱图碎片数据输入数据库，进行批处理搜索。通过大量的比较研究证实，综合运用多种数据库搜索方法，●■摘要蛋白质的生物质谱分析、／都能获得确定的结果。其中，最简便、确定性最高的是MA

6、SCOT批处理搜索。，最后，本论文研究和讨论了热变性对蛋白的结构影响及对酶解效率的影响。比较研究了牛血清白蛋白、溶菌酶、肌红蛋白三种蛋白质，在经过和不经过热变性酶解的质谱分析结果，比较了它们各自的酶解效率和在数据库中的匹配情况。阐明了热变性形成蛋白集结物的机理，并总体上增强蛋白与酶的作用，提高酶解效率。证实了酶解前对蛋白进行热变性的必要性。该项研究是质谱在蛋白质结构分析中的一个有价值的应用。关键词：电喷雾质谱，HPLC，CID，蛋白质缝《举争乙7L“Ⅱ●垒!坐坚!丝型坚垫g!!!!!i墅堕里!!坐竺

7、!!里!!塑里!堕AnalyzingProteinsbyBiomassSpectrometryAbstractIntheearlyof90’s，thenewionizationtechniquesuchaselectrosprayandmatrix—assistedlaserdesorptionhasbeenemerged，thentheidentificationofmacromolecularproteinsbymassspectrometrybecometheroutineanalytical

8、technique．Priortothetraditionalanalyticalmethodsforproteins，massspectrometrytechniquehasbeenpaidmoreattentionbybiologicalandchemicalresearchersduetoitshighspeed，highsensitivityandexcellentcapabilitytoprovideabundantstructureinformation．