利用ssr分子标记初步分析广西莪术种质资源的遗传多样性

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1、利用SSR分子标记初步分析广西莪术种质资源的遗传多样性摘要：利用简单重复序列分子标记技术对广西莪术(CurcumakwangsiensisS.G.LeeetC.F.Liang)种质资源进行了遗传多样性分析。结果表明，筛选出的14对引物在50份广西莪术种质资源中共扩增出78个条带，其中60条呈现多态性，多态性比率为76.92%，反映出广西莪术种质资源在分子水平上存在较大的差异；广西莪术不同种质资源间的差异主要由遗传因素决定，但也与环境因素有关。聚类结果将50份广西莪术种质资源分成2大类，揭示了它们之间的遗传差异，这为今后广西莪术优良品种的选育提供了依关键词：简单重复序列分子标记；广西莪术(Cur

2、cumakwangsiensisS.G.LeeetC.F.Liang)；遗传多样性分类号：Q943.2；Q949.71+8.33；Q16文献标识码:A文章编号：0439-8114(2015)10-2408-04D0I：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.10.027广西莪术(CurcumakwangsiensisS.G.LeeetC.F.Liang)为姜科(Zingiberaceae)姜黄属(CurcumaL.)植物，以干燥根茎入药，其味辛、苦，性温，具有行气破血、消积止痛的功效，可用于症瘕痞块、淤血闭经、食积胀痛等病征以及早期宫颈癌的治疗，是中医临床上较为常

3、用的活血化瘀药材［1］。现代药理研究表明，广西莪术所含的莪术油是一种很有发展前途的抗肿瘤、抗血栓和抗病毒药物［2-4］。广西莪术是广西壮族自治区主产的地道药材，产区面积大，近年来关于莪术挥发油成分的研究越来越多，但对广西莪术的品种选育和种植技术改良未受到应有的重视。多年来，广西莪术育种工作侧重于常规技术，许多分子水平上的研究工作有待开展。试验利用简单重复序列(Simplesequencerepeats,SSR)分子标记技术对产自于广西壮族自治区的50份广西莪术种质资源进行了遗传多态性分析，旨在揭示广西莪术种质资源的遗传多样性，以期为广西莪术选育高产优质新品种提供科学依据。1材料与方法1.1植物

4、材料供试广西莪术种质材料共有50份，是从多年收集到的广西莪术原始材料中选育出来的，分别采自广西壮族自治区的玉林市、兴业县、钦州市、灵山县、贵港市、桂平市、平南县、钦北区、横县、邕宁区、金秀瑶族自治县等地，从2000年起集中栽植于南宁市仙葫种植基地内。试验前其生长状况优良，有关信息见表1。经王建教授鉴定，并经过药材性状数据分析，参试的各样品确认为姜科植物广西莪术无疑。1.2基因组DNA提取选取参试各种质材料生长状况良好的新鲜健康嫩叶，经前期消毒处理后提取DNA，提取方法参照经典的CTAB法［5］，稍加改良。提取所得总DNA于-20°C环境里保存。1.3引物筛选和SSR-PCR反应体系优化聚合酶链

5、式反应(Polymerasechainreaction,PCR)扩增引物参照文献［6］公布的姜黄属通用的17对引物选取，由上海生工生物技术工程服务有限公司合成，详见表2。随机选用10个参试的广西莪术种质材料，参照Komatsu等［7］的SSR扩增条件稍加改良进行引物筛选，从姜黄属通用的17对引物中选取扩增条带清晰、重复性好、多态性高的15对引物作为本次试验的引物。最终确定的PCR反应体系为：DNA模板3PL、引物1PL、2XTaqPCRMasterMix6nL(TaqDNAPolymerase）、Recombinant0.05units/pL、MgC124mmol/L、dNTPs（dATP、d

6、CTP、dGTP、dTTP）0.4mmol/L、加ddH20至15uL。以此建立的SSR反应体系稳定、重复性好。PCR反应程序参照文献［8］，略有改动；扩增反应是在德国BiometraTProfessionalPCR仪上进行，扩增程序为：94°C预变性5min;94°C变性30s，55°C退火45s，72°C延伸1min,35个扩增循环；最后72°C延伸10min。1.4凝胶电泳与染色PCR产物在7%的聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE，5Ug/mL)中于200V稳压里电泳45〜60min,凝胶电泳分离后进行银染，观察，并用CanoScan9000F扫描仪扫描得到图谱。根据图谱分析各SSR位点的

7、扩增情况，包括是否扩增、各位点在不同材料中所得到的等位基因数量。1.5遗传多样性分析电泳扩增结果直接记录凝胶带型，并按基因型分别统计。选取清晰可辨的电泳条带，每条带代表引物与模板的1个结合位点，视每个多态性条带为1个等位基因，将观测到的每条带视为一个性状，有此带时赋值为1，无此带时赋值为0，将所有试验数据在MicrosftOfficeExcel2003软件里进行标准化处理，统计后将（0，1）矩阵输