酸性蛋白酶实验方案

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1、酸性蛋白酶降解猪瘦肉肉实验方案一、实验目的①购得黑曲霉发酵生产的酸性蛋白酶，并在其最适条件下进行研究②研究该酸性蛋白酶降解瘦肉的降解肉类效果、对酵母生长的影响。③根据实验前后的含氮量，研究该酸性蛋白酶对瘦肉的降解度二、实验原理①酸性蛋白酶特性：活力定义：一个酶活力指1g酶粉成1ml酶液在40℃.PH3.0条件下，1分钟水解酪素产生1ug酪氨酸为一个活力单位（u/g或u/ml）pH范围：2.5～4.0（最适PH3.5）最适温度：55℃，低于40℃稳定性状：褐色或灰色粉末，由黑曲霉经发酵提炼而成而成，易溶于水用途：生化研究。水解蛋白, 具有

2、较强的水解能力能力，能将大分子的蛋白质水解成氨基酸等②水解度(DH)的计算公式:DH(%))=水解液中总氨基态氮/原料中总氮含量[1]③凯氏定氮法测总氮：凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收，再以标准碱滴定，就可计算出样品中的氮量。三、实验试剂和仪器①实验试剂：新鲜瘦猪肉(市售)；酸性蛋白酶(5.0×105IU/g)(广州市凯升生物有限公司)、凯氏定氮法相关试剂②实验仪器：凯氏定氮蒸馏装置,雷磁酸度

3、计,恒温水浴锅,电子天平、电磁炉四、实验方法①新鲜猪瘦肉预处理从市场上购得猪肉，清水洗净后，用小刀精心除去脂肪，将猪肉用自来水冲洗，去血1h后，冷冻保藏，一段时间后取出并切成块状，然后经高压灭菌灭菌，用无菌水冲洗，放置冰箱冷冻备用[3]。②猪肉酶解工艺流程猪肉糜(经预处理)→配制pH3.5的柠檬酸缓冲液→按固液比（m/V）1：1匀浆[1、3]→加酶保温酶解→100℃灭酶15min→4500r/min离心15min→上清液过滤→猪肉蛋白酶解液[3]③单因素实验组别设置在酶解时间5h、pH3.5条件下实验，设置一个不加入酶的空白对照，每组设

4、置3组平行对照：＊温度条件：55℃、30℃＊酶液加入量：按3%（M/M）（酶：底物）加入量[1]＊酵母培养：加入蛋白酶按6.5U/mL（酶：培养基）比例、不加蛋白酶对照进行液体培养猪瘦肉用量：每组15g，共8组，共120g。④总氮含量测定采用凯氏定氮法⑤柠檬酸缓冲液配制方法柠檬酸–柠檬酸钠缓冲液（0.1mol/L）pH0.1  mol/L柠檬酸（毫升）0.1  mol/L柠檬酸钠（毫升）pH0.1  mol/L柠檬酸（毫升）0.1  mol/L柠檬酸钠（毫升）3.03.23.43.63.84.04.24.44.64.818.617.21

5、6.014.914.013.112.311.410.39.21.42.84.05.16.06.97.78.69.710.85.05.25.45.65.86.06.26.46.68.27.36.45.54.73.82.82.01.411.812.713.614.515.316.217.218.018.6柠檬酸C6H8O7·H2O：分子量210.14，0.1mol/L溶液为21.01克/升。柠檬酸钠Na3C6H5O7·2H2O：分子量294.12，0.1mol/L溶液为29.41克/升。 柠檬酸C6H8O7·H2O:2.1g柠檬酸钠Na3C

6、6H5O7·2H2O:2.94gH2O:100ml物参考文献[1]李小华等.猪肉蛋白酶法水解优化工艺研究[2]车金林等.用宇佐美曲霉酸性蛋白酶水解鸡肉的研究[3]李俊江等.鹅肉蛋白酶解条件优化及酶降解产物抗氧化活性研究