乙型肝炎病毒截短c基因与前s1基因在大肠杆菌中的融合表达及纯化

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1、乙型肝炎病毒截短C基因与前S1基因在大肠杆菌中的融合表达及纯化【关键词】,乙型肝炎病毒ExpressionandpurificationoftruncatedCgenebinedHBVinE.coli　【Abstract】AIM:ToconstructtheprokaryoticrebinantplasmidtoexpressHBVtruncatedCgeneplifiedbyPCRanddigestedbyrestrictiveenzymebeforeclonedintopET28a.ItedintoE.coliDH5αandthepositiverebinantpla

2、smidnamedpET28aCtpreS1edintoE.coliBL21andinducednandidpET28aCtpreS1ainlyn.Thepurifiedproteinmaintainedtheantigenactivity.CONCLUSION:ThetruncatedHBcAgbinedmol/LdNTPs4μL，P1（100pmol/L）2μL，P2（100pmol/L）2μL，TaqDNA聚合酶2μL，用超纯水补至终体积50μL.反应条件：预变性94℃5min；94℃1min，56℃50s，72℃1min,共进行30个循环，最后在72℃延伸10mi

3、n.取5μL反应产物进行琼脂糖电泳分析.　　1.2.3pET28aCtpreS1重组质粒的构建及鉴定连接、转化、重组质粒鉴定均参照文献［1］进行，将酶切鉴定正确的重组质粒交由北京三博远志公司测序.　　1.2.4蛋白表达和可溶性分析自DH5α中提取阳性重组质粒，转化大肠杆菌BL21，挑取单菌落（同时设空载体质粒转化的大肠杆菌BL21为对照），置5mLLB培养液中（含卡那霉素50g／L），37℃振摇过夜，次日1∶100的稀释度加入5mLLB培养液中37℃振摇3h后，测定A600nm约0.4～0.6时加入IPTG至终浓度1mmol/L，37℃继续振摇4～5h，离心收菌.用PBS

4、(pH8.0)悬浮离心收集的细菌，加入溶菌酶至终浓度0.1g/L，4℃放置20min，超声破碎，4℃下10000g离心10min，收集上清和沉淀.将菌体沉淀、裂解上清、裂解沉淀和空质粒转化菌分别加入等体积的2×样品缓冲液，沸水中加热5min，12000g离心5min，取上清，每孔15μL进行SDSPAGE电泳，电泳在恒压下进行（浓缩胶中为100V，分离胶中为120V）.电泳结束后，将凝胶浸泡于考马斯亮蓝染色液中染色2h，然后用脱色液脱色至背景清晰.薄层扫描分析目的蛋白表达带占菌体蛋白百分比.　　1.2.5亲和层析法纯化表达蛋白参照Qiagen公司镍离子亲和层析柱(Ni2+

5、NTA)操作说明进行.首先离心收集1L诱导宿主菌，冰浴15min；按5L/kg湿菌的比例加入含8mol/L尿素的BufferB（pH8.0），室温下轻轻搅拌使细菌裂解至溶液清亮，4℃下10000g离心收集上清，弃去沉淀；将1mLNi2+NTA树脂悬浮液与一定量清亮裂解上清于室温轻柔摇动混匀(100r/min摇动15～60min)后，将其混合液装柱；依次用BufferC（pH6.3）,BufferD（pH5.9）,BufferE（pH4.5）洗脱，分别收集洗脱液.取各部分样品进行SDSPAGE分析.　　1.2.6，转移条件为恒流100V，1h）.用乙型肝炎阳性患者抗HbcA

6、g，抗preS1阳性血清（来自西京医院检验科）作为一抗，HRP标记羊抗人的IgG作为二抗，DAB（0.6g／L）显色，至目的条带染色清晰时终止反应.　　2.3融合蛋白的大量表达及纯化目的蛋白在BufferD（pH5.9），BufferE（pH4.5）洗脱液中，扫描显示纯度在90%以上（图3）.　　2.4表达蛋白的aniatisT.Molecularcloning：Alaboratorymanual［M］.3rded.NeiK,IsogamunogenicityandtolerogenicityofhepatitisBvirusstructuralandnonstructu

7、ralproteins:Implicationsforimmunotherapyofpersistentviralinfections［J］.Virology,2002,76(9):8609-8620.　　［3］LoiratD,LemonnierFA,MichelML.MultiepitopicHLAA*0201restrictedimmuneresponseagainsthepatitisBsurfaceantigenafterDNAbasedimmunization［J］.Immunology,2000,165(7):47