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1、缺氧对血管生成素[]目的探讨缺氧对血管生成素-2(Ang-2)在人结肠癌细胞SEM培养基(Gibco公司),0.25%胰蛋白酶(AMRESCO公司)消化传代。 1.2细胞分组和缺氧处理将在培养瓶内生长良好的SEM培养基，置于37℃、5%CO2培养箱预培养12小时。然后置细胞于37℃、体积分数95%N2，5%CO2混合气体(杭州今工气体有限公司)的厌氧培养箱(浙江义乌冷冻机总厂)，分别按规定时间进行孵育。 1.3RT-PCR检测Ang-2基因表达取上述孵育的细胞按Trizlo试剂盒(BioBasicInc)说明一步法提取S3000)测定RNA纯度并定量。取总RNA行逆转录
2、,逆转录体系及过程为:RNA2μg、0.05μg/μloligo(dT)1810μl,混匀,70℃5min,冰上冷却3-5分钟,依次加入M-MLV5×ReactionBuffer5μl、10MmdATP、dGTP、dTTP、dCTP各1.25μl、RNasinI25U、M-MLV逆转录酶200U(均为Promega公司产品),补水至25μl,混匀,42℃60min，95℃10min,4℃保存。分别PCR扩增Ang-2和内参照GAPDH。特异性引物由上海生工合成。引物序列Ang-2:sense,5-GTCCACCTGAGGAACTGTCT-3,antisense,5-TTGT
3、GACAGCACCGTCTGTA-3,扩增片断长度289bp;GAPDH:sense,5-GTCAGTGGTGGACCTGACCT-3,antisense,5-CCCTGTTGCTGTAGCCAAAT-3,扩增片断长度251bp。PCR扩增体系为10×TaqBuffer5μl、25mMMgCl25μl、10mMdNTP1μl、10pmol/μl上下游引物各1μl、cDNA0.6μl、Taq酶1μl(上海申能博彩)、去离子水补至终体积50μl。反应条件95℃5min，94℃50sec，56℃40sec，72℃30sec，共30个循环，最后72℃10min,4℃保存。取10μl
4、PCR扩增产物，1.5%琼脂糖凝胶电泳，电泳完毕后，应用凝胶扫描仪对电泳带进行吸光度扫描，并以GAPDH校正做相对量分析，数值以两者积分吸光度的比值表示。 1.4统计学分析吸光度以(x±S)表示,用单因素方差分析，用SPSS11.0for为100bpDNAladder。 3讨论血管生成素(Angiopoietin，Ang)是近年来发现的血管内皮细胞特异性的血管生长调节因子，被认为是独立于VEGF受体途径的血管新生途径，任何一条都不能被另一条替代。血管生成素包括Ang-1、Ang-2、Ang-3和Ang-4，其配体为Tie-2。Ang-2在肿瘤血管新生中起重要作用[1]，
5、在许多实体肿瘤如肝癌、肺癌、胃癌等的血管新生中，Ang-2表达于肿瘤边缘的血管重建区，参与肿瘤血管新生的起始及延续过程，影响肿瘤生长和转移。 缺氧是实质性肿瘤物理微环境的基本特征之一，是血管新生的一个强有力的刺激因素，与肿瘤的演进和转移有密切的关系。越来越多的证据表明缺氧是决定恶性肿瘤预后的重要因素[2]。缺氧不仅可以诱导肿瘤细胞对放疗及化疗的耐受性，更重要的是缺氧还可以促进肿瘤细胞的生长、浸润和转移等恶性生物学行为的发生。大多数体积大于1mm3的实质性肿瘤都含有相当数量的缺氧的肿瘤细胞，这主要是由于肿瘤内血管结构和功能的异常所致的肿瘤细胞血供和氧供减少以及肿瘤细胞的快速
6、增殖所致的肿瘤细胞氧耗增加。在恶性肿瘤中缺氧促进许多基因的表达产物参与抵抗缺氧所致的细胞损伤，保护肿瘤细胞，促进肿瘤细胞恶性转化的重要作用，如血管内皮细胞生长因子(VEGF)、白介素-8(IL-8)、血小板源性内皮细胞生长因子(PDECGF)、thrombospondin-1(TSP-1)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、adrenomedullin(ADM)等。胡振红等[3]研究发现，适度缺氧可以使肺癌细胞H128迁移能力增强，浸润能力增加。 缺氧与Ang-2表达的相互关系主要是在内皮细胞及少量肿瘤中研究所得，且两者的关系存在不一致。Abdulmalek等[4]研究发现
7、在小鼠小脑内缺氧导致Ang-2mRNA表达升高，主要是通过HIF-1的途径来实现的。Mandriota认为在牛内皮细胞中缺氧导致Ang-2mRNA的表达增加[5]。也有认为缺氧不影响Ang-2mRNA的表达，甚至有表达下降。在肿瘤，尤其是结直肠肿瘤中关于缺氧对Ang-2的表达影响国内外未见相关报道。本研究通过采用半定量RT-PCR技术检测人结肠癌细胞SVD)inhumancolorectaltumors[J].JournalofZhejiangUniversity:MedicalSciences,2006,35(2
