冰片促进葛根素和梓醇口服吸收入脑的研究

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1、冰片促进葛根素和梓醇口服吸收入脑的研究［摘要］从细胞水平和动物水平考察冰片对葛根素和梓醇口服吸收及穿透血脑屏障入脑的影响，筛选适合梓葛复方口服制剂的冰片浓度。采用原代大鼠脑微血管内皮细胞和星型胶质细胞共培养建立体外血脑屏障模型，利用此模型研究62.5〜100mg•L-1冰片对葛根素、梓醇转运的影响。小鼠分别灌胃给予0，2.5，50，100mg-kg-1冰片溶液后再立即灌胃给予葛根素（200mg•kg-1）、梓醇（4.5mg•kg-1）纳米晶混悬液，比较葛根素、梓醇在血浆和脑组织中的药动学参数。脑微血管内皮细胞和星型胶质细胞共培养7d后，屏障功能基本形成。与未加入冰片组相比，冰片质量

2、浓度为1.2.5〜100mg•L-1时，葛根素、梓醇跨血脑屏障模型的渗透系数显著增大（P98%，四川玉鑫药业有限公司，批号1.40602）；对羟基苯甲醛（纯度＞98%，上海源叶生物科技有限公司，批号YY91.2.50）;梓醇（纯度＞98%，石家庄流波白鸟生物科技有限公司，批号1.10808200508）;桃叶珊瑚苷（纯度＞90%，潮州市泽润制药有限公司，批号20101.11.2）;荧光素纳（纯度＞99%，上海源叶生物科技有限公司，批号YY1.1.3.902.5g）；甲醇、乙腈（色谱纯，Fisher公司）；其余试剂均为分析纯；冰片购自和平药房，经齐红艺教授鉴定，符合《中国药典》要求。

3、雌雄KM小鼠，清洁级，购于重庆市中药研究院实验动物研究所，生产许可证号SCXD（渝）201.30006，实验动物质量合格证号No0003.788。2方法2.1血脑屏障模型的建立2.1.1细胞共培养模型的建立脑微血管内皮细胞（BMECs）的培养与种植参照文献［14］，从新生2周的乳鼠获取原代脑微血管内皮细胞，于3.7°C、5%C02培养箱中培养。取细胞融合度为80%〜90%的BMECs，消化，收集细胞并调整密度至5X105个/mL，种植于细胞培养池内，1mL/孔。星型胶质细胞（AS）的培养与种植：参照文献［14］，从新生3d左右的乳鼠获取原代星型胶质细胞，于3.7°C、5%CO2培养

4、箱中培养。取细胞融合度为80%〜90%的AS，消化，收集细胞并调整密度至5X105/mL,种植于Transwell池的背侧，1mL/孔。2.1.2血脑屏障模型的鉴定2.1.2.1跨内皮细胞电阻值的测定将培养板取出，DHanks室温平衡30min，测定跨内皮细胞电阻值TEEREc+filter,同时以无接种细胞的培养池作为对照，测定滤层的电阻值TEERfilter。单层内皮细胞的电阻值TEEREc二(TEEREc+filter-TEERfilter)XS(膜面积S=4.67cm2)。2.1.2.2荧光素纳透过性分别测定质量浓度为004.32.4，04.3.24,4.3.2.4,4.3

5、.2.4,4.3.2.4mg•L-1的荧光素纳对照品溶液在激发波长4.20nm和发射波长5.4.5nin处的荧光强度，绘制成荧光素钠的荧光强度对浓度作标准曲线。在接受池中加入2mLDEMEF1.2液，在供体池中加入1mLDEMEF1.2液，于3.7°C预孵育30min后将供体池的DEMEF1.2换成1mL质量浓度为2.1.62mg•L-1荧光素纳的DEMEF1.2液，分别于作用后的1.5，30，60，90，1.20min,从接受池中取出100uL渗透液，立即补充相同体积的空白DEMEF1.2液。测定渗透液中荧光素钠的荧光强度，计算荧光素钠的浓度。参考文献［15］，按下式计算渗透系数

6、Papp=(dQ/dt)/(1/AXC0)。其中dQ/dt为荧光素钠的转运速度，A为Transwell池的扩散面积(A=4.67cm2)，CO为供体池中的初始浓度性的影响2.2冰片对BMECs和AS细胞活取融合度为80%〜90%的细胞，按5X105个/cm2的密度接种于96孔板，分为空白对照组、正常对照组和试验组共7个组。空白对照组不加入细胞，正常对照组用等体积的DHanks液代替药物，各实验组加入葛根素(100mg*L-l)、梓醇(2.2.5mg•L-1)和冰片(质量浓度分别为1，10,50,100，200mg-L-l）的DHanks混合溶液100uLo药物作用2.4h后，每孔加

7、入5g•L1的MTT液20uL,3.7°C孵育4h。终止培养，弃去上清液，加1.50uLDMSO，振摇混匀10min。测定4.90nm处的吸光度，按下试计算细胞存活率，选择存活率大于90%的冰片进行后续试验。细胞存活率=［（Asample-Ablank）/（Acontrol-Ablank）］X100%2.3冰片促进葛根素和梓醇跨BBB模型的转运试验在共培养的第7天，供体池和接收池分别加入1，2mLDHanks,平衡30min后吸去供体池中的液体，然后加入1mL葛根素、