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1、HLA分型技术在骨髓库上海分库高分辨检测工作中的初步应用刘嫵杨剑豪郑皆炜谢军华孙瑛杜可明（上海血液屮心HLA高分辨实验室200051）【摘要】HLA分型技术在骨髓库上海分库高分辨检测工作屮的初步应用。方法：使用ABI3730XIDNA测序仪，采用SBT单链直接测序法，对上海地区的960份自愿加入屮华骨髓库的志愿者血液标本进行DNA测序，其屮HLA-I类基因对第2,3和4外显子单链单向测序，II类基因对第2外显子单链单向测序，以得HLA高分辨分型结果；对部分呈现血清学表达不一致的模棱两可高分辨结果标本，
2、通过SSO技术确认；对部分呈现血清学表达一致的模棱两可高分辨结果标本，通过SSP或对2，3，4以外的外显子单链检测作进一步确认。结果：960份屮华骨髓库上海分库的样本进行HLA的PCR-SBT高分检测，用DNA单链测序法一次性获得高分辨结果为720例；对部分呈现血清学表达一致的模棱两可高分辨结果标本，通过SSP技术或2,3,4以外的外显子单链检测做进一步确认，共计标本211例；对于部分呈现血清学表达不一致的21例模棱两可高分辨结果标本我们采用SSO技术最终确认了唯一的高分结果；此外，还检测到待确认新基
3、因4例。完成丫本次实验标本100%高分结果入库要求。结论：SBT单链测序技术为主，PCR-SSO,PCR-SSP联合为辅，是骨髓库开展HLA高分辨分型工作的有力工具。【关键词】SBT单链测序技术PCR-SSOPCR-SSPHLA高分辨分型屮华骨髓库上海分库人类主要组织兼容性抗原分子对于T细胞免疫的专一性鉴别扮演极重要的角色[1],在器官或骨髓的移植过程屮，捐赠者及受赠者的人类主要组织兼容性抗原分子兼容程度对于移植结果有相当大的影响，因此双方的HLA分型鉴定是移植之前一个必要的步骤。每年，屮华骨髓库都对
4、每位志愿加入屮国造血干细胞捐献者资料库的志愿者做采样及HLA分型工作，为了提高库容使用率，增大移植量，减少流失率，骨髓库对HLA分形结果的要求也愈来愈高。过去对HLA的检测主要采用血清学方式［2］，但由于HLA基因具有相当高的多态性，大多HLA抗原之间仅有极少数、甚至只有一个氨基酸的差异存在，因此以过去的血清学方式已经无法像DNA检测方式一样有效的进行HLA分型,PCRSBT,SSO,SSP等检测技术正逐渐取代成为HLA检测的主要手段。1材料与方法1.1标本来源上海地区的960份志愿者血液标本。1.2
5、血样采集和基因组DNA制备静脉抽取受检者全血（EDTA抗凝）5ml,用DNA提取试剂盒（美国TexasBioGene公司）提取基因组DNA,供PCR-SSO,PCR-SSP和DNA测序用，剩余血标本于-80°C冻存备用。1.3DNA单链序列分析用PCR-SBT高分辨测序分型试剂（美国TexasBioGene公司,）。严格按试剂说明书操作，首先取基因组DNA加酶和Buffer进行DNA扩增，再用1.5〜2%琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行确认；最后消化酶对扩增产物进行纯化，在ABI3730XIDNA测序仪上
6、作序列检测。所获数据用ACCUTYPE分型软件处理生成HLA分型报告。1.4PCR—SSP严格按试剂说明书操作，根据HLA核苷酸碱基序列的多态性设计出特异性引物，和DNA序列互补结合，经PCR反应产生相应条带,若组中存在与特异性引物互补结合的DNA序列，即样本为该SSP结合的HLA基因阳性。1.5PCR—SSO技术（序列特异性寡核苷酸聚合酶链反应）严格按试剂说明书操作，利用多种等位基因特异碱基序列的互补寡核苻酸探针，与特定片段PCR扩增产物进行杂交，用荧光免疫检测系统检测，在短吋间内鉴定DNA的多态性
7、。2结果2.1采用DNA提取试剂盒提取DNA,DNA样本必须溶解于火菌水或溶解液中，每份DNA的浓度调整至10-40ng/l,A260/A280比值介于1.65至!J1.8之间。2.2960份中华骨髓库上海分库的样本进行高分检测，用DNA单链测序法一次性获得高分辨结果为720例，约占总检测标本量的75%;针对部分呈现血清学表达一致的模棱两可高分辨结果标本，我们又通过SSP技术或2,3,4以外的外显子单链检测做进一步确认，共计标本211例，约占总检测标本量的22%；针对部分呈现血清学表达不一致的21例模
8、棱两可高分辨结果标本，我们用SSO技术最终确认了唯一血清型，约占总检测标本量的2%;此外，还检测到待确认新基因4例。至此，除新基因外，我实验室完成了本次实验标本100%高分结果入库。3讨论HLA(HumanLeukocyteAntigen,HLA)是具存高度多态性的人类免疫遗传基因，位于人类第六号染色体短臂上的HLA基因具有相当高的多态性，在非血缘造血干细胞移植(UnrelatedHematopoieticStemCellTransplantation，
