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1、深低温冷冻对rhBMP(1)【关键词】气管 EffectofcryopreservationonrhBMP2inducedregenerationofdogstrachealcartilage 【Abstract】 AIM:Toconfirmthevalidityandpotentialapplicationofimplantingtherebinanthumanbonemorphogeicprotein2(rhBMP2)ongreldogslyandequallydividedinto4groups.Fiveringcervicaltrachealsegmenten
2、tum.GroupAonthsbeforetheoperation,alsortemspecimensinedgrosslyandhistologically.Areaofneoreneationinthecryopreservedrachealallografts.Cryopreservedtrachealallograftshavebetterneorphogeicproteins 【】目的：研究应用重组人骨形态发生蛋白2(rhBMP2)/胶原缓释系统诱导犬冷冻气管移植软骨再生的作用.方法：将32只杂种犬随机等分为4组,行5个颈部气管环原位异体移植，带血管蒂大X膜包
3、绕.A组为未冷冻组，气管环间植入rhBMP2/胶原组标记为A1组，空白对照标记为A2组；B组术前将移植体气管经深低温液氮保存2mo，处理同A组，分别标记为B1、B2两组.所有实验犬于术后8o后气管软骨细胞数会降为原来的65%~75%之间［3,4］，且移植后由于缺血及轻微的慢性排斥反应，气管移植体的软骨会被进一步损伤［5］.我们根据以往气管移植系统研究的思路［6,7］,应用重组人骨形态发生蛋白－2(rebinanthumanbonemorphogeicprotein-2,rhBMP2)/胶原缓释系统植入深低温冷冻的犬气管移植体诱导软骨再生.试图抵抗冷冻对气管移植体的损伤,从
4、而最大程度保持冷冻移植体的生理结构和功能. 1材料和方法 11材料选择西安地区健康成年杂种犬32只,均为雄性,体质量15～20kg.①rhBMP2由第四军医大学西京医院全军骨科研究所提供，小鼠肌袋生物学活性试验证实rhBMP2诱导成骨活性良好;②胶原的制备:根据文献［8］方法,用胃蛋白酶液消化新鲜牛腱，经纯化后获得Ⅰ型胶原溶液，冻干保存备用；③rhBMP2/胶原缓释系统的制备:取560mg胶原冻干品，溶于适量001mol/L盐酸溶液,将pH值调至5,使其成为较黏稠的液体.rhBMP2干粉112mg溶于适量灭菌水后，将其倒入制备好的胶原溶液中.持续搅拌直至rhBMP－2
5、与胶原充分混匀.再将此rhBMP－2/胶原溶液均匀分成28份，冻干，冻干品呈白色海绵状.均用环氧乙烷消毒后，密封保存于4℃下备用.使制备的每份复合物含rhBMP2为4mg，胶原20mg；④冷冻保护液：以RPMI1640培养液为培养基,在洁净工作台内配制冷冻保护液,其他成分和浓度分别为200g/L胎牛血清，100g/L二甲基亚砜，100000U/L青霉素，100mg/L链霉素和200mg/L二性霉素B. 12方法 121动物分组将32只杂种犬随机等分为4组.A组为未冷冻组，气管环间植入rhBMP2/胶原组标记为A1组，空白对照标记为A2组；B组术前将移植体气管经深低温液
6、氮保存2mo，处理同A组，即气管环间植入rhBMP2/胶原组标记为B1组，气管环间未植入rhBMP2/胶原组标记为B2组. 122异体气管冷冻准备切取犬颈部5个环的气管段.经生理盐水冲洗,并在200000U/L青霉素和200mg/L庆大霉素溶液中浸泡3min后用于即刻移植.B组先将供体气管放入无菌生物冷冻袋,使气管浸没于冷冻保护液中，置于4℃冰箱冷平衡20min，再于程控降温仪的冷冻箱中程序降温，降温速率1℃/min，至-80℃后投入液氮保存2mo.移植前将冷冻袋从液氮中取出，置于37℃恒温水浴箱内，轻轻摇动，使气管段均匀快速解冻复温. 123气管移植手术速眠新(01
7、5mg/kg)im全身麻醉.仰卧位固定于手术台上,经口气管插管，自主呼吸.颈部正中纵形切口，长约10cm.分离皮下及肌肉组织显露颈段气管，切开气管前筋膜.切取5个环气管段.A1，A2两组同时开始手术，术中交换气管移植体，行即刻移植，B组供体气管复温后反复冲洗其上残留的冷冻保护液，各组供体气管移植前均经大量生理盐水冲洗1min浸泡于200000U/L青霉素和200mg/L庆大霉素混合溶液中2min，所有移植体各环间均匀植入rhBMP2/胶原载体复合物,方法见下述.用3~0无损伤缝合线于移植体与受体气管断端行褥式吻合，将其移植于缺
