大青叶有效单体抗呼吸道合胞病毒作用的实验研究.doc

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1、大青叶有效单体抗呼吸道合胞病毒作用的实验研究【摘要】目的探讨中药大青叶单体1#，2#，3#，4#体外抗呼吸道合胞病毒（RSV）的作用。方法通过观察病毒引起的细胞病变效应和MTT[MethylThiazolylTetrazolium,3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐]法检测药物抗RSV活性，计算药物对病变的抑制率和半数抑制浓度，并从药物抗病毒吸附，药物对病毒的直接杀灭作用及抑制病毒在细胞内的生物合成3个方面初步探索大青叶单体抗RSV活性的作用机制。结果大青叶单体1#，2#，3#

2、，4#对RSV无直接灭活作用，也不能阻止RSV的吸附，而能抑制RSV在Hep-2细胞内的的生物合成，其半数抑制浓度（IC50）分别为，，：yg/ml，治疗指数（TI）分别为，，，，其抗病毒效果优于病毒唑（IC50=g/ml,T»和抗病毒口服液（IC50二Pg/ml，TI=），P【关键词】大青叶单体呼吸道合胞病毒细胞病变效应法MTT法大青叶为十字花科植物蒋蓝IsatisindigoticaFort的干燥叶。味甘，气寒，无毒，入肝、心、胃经，清热凉血，为解毒要药。《名医别录》记载：“疗时气头痛，大热，口

3、疮。”《本草纲目》记载：“主热毒痢，黄疽，喉痹，丹毒。”它既能清心胃实火，治温热病心胃毒盛，发斑发疹，又善解毒利咽，凉血消肿，用治喉痹口疮、咽喉肿痛。据报道，大青叶在临床上多用于流行性感冒持续高热、上呼吸道感染、流行性乙型脑炎、急性传染性肝炎等病毒性疾病。而呼吸道感染中90%以上是由呼吸道病毒引起，其中呼吸道合胞病毒居首位［1］。鉴于此，我们从中药大青叶中提取有效成分，制备成大青叶单体，实验选用微孔细胞培养和MTT法，以Hep-2细胞作为体外筛选细胞模型，检测其对RSV的抑制作用，为筛选新型抗病毒药

4、物和大青叶的临床应用提供思路和理论依据。1材料中药大青叶单体1，2，3，4#，由华中科技大学同济医学院同济医院药剂科方建国教授提供。病毒唑和抗病毒口服液由南京第三制药厂生产，批号080302。Hep-2（鼻咽癌）细胞为武汉大学典型培养物保藏中心提供，RSV由英国Glasgow大学儿童卫生系Paton博士赠送。RPMI-1640和MTT为Hyclone公司产品。二甲基亚讽由上海菲迗有限公司提供。新生小牛血清购自三利公司。2方法病毒滴度测定将毒株作10倍系列稀释，每个稀释度重复10孔，同时设正常细胞对照

5、。于37°C下孵育2h，换细胞维持液。每天观察细胞病变效应，约3〜7d后CPE不再增多时，按Reed-Muench方法计算TCID50。药物对细胞的毒性的测定用乙酶将生长良好的Hep-2细胞分散成单个细胞悬液，按1x105/ml浓度分种于40孔板，每孔ml。置33°C，5%C02培养箱中培养24h。待细胞长成单层后，弃培养液上清，换含不同浓度的含药维持液，每孔200ulo大青叶1，2,3,4#单体的浓度分别为10,20,40,80，160,320,640,800，1600ug/mlo每种浓度重复4孔

6、，实验同时设正常细胞对照、病毒对照、阳性药物病毒唑和中药抗病毒口服液对照。继续培养48h后，以MTT法检测细胞存活率。并根据如下公式计算细胞存活率，找出药物对细胞的最大无毒浓度范围。细胞存活率=xioo%。细胞活性测定（MTT染色法）根据Mosmann建立的四甲基偶氮唑盐法测定细胞活性。弃培养上清液，每孔加5mg/mlMTT的不含血清的RPMI-16405Oul,37°C,5%C02孵育4〜6h，黄色的MTT被活细胞的线粒体脱氢酶还原成蓝色的甲簪结晶小心吸出MTT,PBS洗3次，每孔加50P1DMS

7、0终止反应，振荡混匀，在15min后甲赞结晶被溶解，在波长570nm下测定吸光度0D值。0D值与活细胞的数量呈正相关。药物抗RSV活性机理的实验药物对RSV生物合成的抑制作用实验于已长成单层的Hep-2细胞40孔板上，每孔接种100u1的100TCID50的RSV病毒液，于33°C吸附90min，弃病毒上清。根据细胞毒性实验的结果，在大青叶无毒浓度范围内，加入2，4，8，16，32，64，128ug/ml的不同浓度的含药维持液每孔ml，每日观察CPE，隔天换新鲜含药维持液。实验同时设正常细胞对照、病

8、毒对照、阳性药物病毒唑和抗病毒口服液对照。约在病毒对照CPE为“+++〜++++”时弃培养液上清，用MTT法检测病毒抑制率，并根据如下公式计算药物对RSV的病毒抑制率［2］。病毒抑制率=药物处理组OD570-病毒对照组0D570细胞对照组0D570-病毒对照组0D570X100%药物直接灭活病毒实验将50u1的100TCID50/ml滴度的RSV和150Pl不同浓度的药物作用4h，反应体系为ml。含并保证药物的终浓度与药效学实验相同。然后将混合液接种于单层Hep-2细