大肠杆菌变种的分子生物学检测方法研究进展.doc

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1、大肠杆菌变种的分子生物学检测方法研宄进展【关键词】大肠杆菌0157;分子生物学；细菌分型技大肠杆菌是最常见的微生物之一，在自然界广泛分布，在动物体内也存在。它具有易培养、生长快、易变异等特点。肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagicE.coli，EHEC)是大肠杆菌的一个变种，曾在多个国家暴发流行。目前美国、加拿大等国家也出现了新的耐药性变种［1］，导致了多人死亡。因此大肠杆菌致病变种引起了国内外学者的密切关注，并对大肠杆菌变种进行了深入的研究。笔者以EHEC血清型0157：H7为例，对它的分子生物学检测方法进行综述，为对该菌引起的疾病进

2、行预防、诊断和治疗提供参考依据。1EHEC基本概况大肠杆菌0157:H7曾多次在世界各地，特别是发迗国家引起广泛的暴发流行。感染主要导致腹泻、出血性结肠炎(hemorrhagiccolitis,HC)，并经常伴发溶血性尿毒综合征(hemolyticuremicsyndrome,HUS)、血栓形成的血小板减少性紫癡(thromboticthrombocytopenicpurpura,TTP)并发症，严重威胁着人类的生命健康［2］。人类感染此菌的途径主要是食用或接触污染的牛肉、蔬菜、水果及水源等。EHEC菌株能产生毒素，编码这些毒素的基因包括志贺菌素1基

3、因（stx1）、志贺菌素2基因（stx2）、大肠杆菌粘附与消除基因（eae）和肠溶血素基因（ehx）等。大肠杆菌0157：H7是与人类疾病相关的最常见血清型细菌。1982年，美国学者首次从出血性腹泻患者的粪便标本中分离到该菌，并报道与食用汉堡牛肉饼有关。这是人类第一次认识到大肠杆菌0157：H7可作为一种病原菌使人类致病，但当时并没有引起医学界的足够重视。此后，大肠杆菌0157:H7引起的感染在美国、加拿大、英国和日本等发迗国家迅速增加，逐渐引起广泛重视。我国于1987年由权太叔等首次从出血性结肠炎患者粪便中分离到0157:H7大肠杆菌。此后，福建、

4、浙江、广东、河北、宁夏等十几个省陆续分离出该菌。为防止类似事件出现，1997年5月建立了全国0157:H7大肠杆菌检测网络。大肠杆菌0157:H7对人的致病力较强，每克感染载体含菌10个以上即可能引起感染。因此，在流行病学调查中，特异、灵敏及快速检测0157:H7的方法显得尤为重要。随着分子生物学技术的迅速发展，使得快速、准确检测O157:H7成为可能，并为该领域的研究开拓了更广阔的前景。2分子生物学检测方法聚合酶链反应（PCR）技术该技术是最常用的检测大肠杆菌0157:H7致病基因的方法。目前已从单一PCR发展到多重PCR乃至实时荧光定量PCRoP

5、aton等［3］采用多重PCR方法扩增stxl、stx2、eae、ehxA和saa基因，发现所检测的ETEC(大肠杆菌0157:H7是其中一种)中，有几种或全部为致病基因。Fey等［4］对335份腹泻患者的粪便样品进行选择性细菌培养，再从中选择可疑菌落进行检测。用多重PCR的方法检测到14株ETEC，与联合应用传统的细菌分离培养和酶免疫法(enzymeimmunoassay,EiA)相比，分离的菌株数相同。从而证明，PCR是一种与细菌常规分离培养和EIA联合应用、具有相同敏感性和特异性的方法。由于其速度快，可作为一种诊断由EHEC感染引起腹泻的替代方

6、法。近年来，随着RQ-PCR的发展，这种技术也被用于大肠杆菌0157:H7的检测。RQ-PCR是利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。常规PCR技术只能对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确定量，也无法对扩增反应进行实时检测。RQ-PCR通过对引物、探针或扩增产物进行荧光标记使对积累的扩增产物进行实时检测成为可能。Ct值即PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数，模板DNA量越多，焚光达阈值的循环数越少，即Ct值

7、越小。朱海等［5］使用RQ-PCR检测生果、蔬菜中大肠杆0157:H7,说明荧光定量PCR检测方法比传统分离培养法灵敏度更高。Beilin等［6］在45min内用这种方法检测了32个EHEC菌株中的stxl和stx2基因，证明实时定量PCR是一种快速检测EHEC的方法。同时，该试验对重复结果为阴性的试验也较为迅速。因此，这种方法在处理大量怀疑含大肠杆菌0157:H7样品时可使用，如在临床微生物中粪便分析或食品安全性检验中的应用。运用PCR方法检测与疾病相关的毒素基因还有助于对疾病发病机理的了解。有研究表明［6］，从ETEC感染患者体内分离的EHEC中

8、，大部分含有与毒力相关的90kb质粒编码的ehxA基因。从引起出血性肠炎和HUS患者体内分离的EHEC中含有