医学论文-大肠杆菌变种的分子生物学检测方法研究进展

《医学论文-大肠杆菌变种的分子生物学检测方法研究进展》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、医学论文-大肠杆菌变种的分子生物学检测方法研究进展【关键词】 大肠杆菌O157；分子生物学；细菌分型技术   大肠杆菌是最常见的微生物之一，在自然界广泛分布，在动物体内也存在。它具有易培养、生长快、易变异等特点。肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagicE.coli，EHEC)是大肠杆菌的一个变种，曾在多个国家暴发流行。目前美国、加拿大等国家也出现了新的耐药性变种［1］，导致了多人死亡。因此大肠杆菌致病变种引起了国内外学者的密切关注，并对大肠杆菌变种进行了深入的研究。笔者以EHEC血清型O157：H7为例，对它的分子生物学检测方法进

2、行综述，为对该菌引起的疾病进行预防、诊断和治疗提供参考依据。　　1 EHEC基本概况   大肠杆菌O157：H7曾多次在世界各地，特别是发达国家引起广泛的暴发流行。感染主要导致腹泻、出血性结肠炎(hemorrhagiccolitis，HC)，并经常伴发溶血性尿毒综合征(hemolyticuremicsyndrome，HUS)、血栓形成的血小板减少性紫癜(thromboticthrombocytopenicpurpura，TTP)并发症，严重威胁着人类的生命健康［2］。人类感染此菌的途径主要是食用或接触污染的牛肉、蔬菜、水果及水源等。   　　

3、EHEC菌株能产生毒素，编码这些毒素的基因包括志贺菌素1基因(stx1)、志贺菌素2基因(stx2)、大肠杆菌粘附与消除基因(eae)和肠溶血素基因(ehx)等。大肠杆菌O157:H7是与人类疾病相关的最常见血清型细菌。1982年，美国学者首次从出血性腹泻患者的粪便标本中分离到该菌，并报道与食用汉堡牛肉饼有关。这是人类第一次认识到大肠杆菌O157:H7可作为一种病原菌使人类致病，但当时并没有引起医学界的足够重视。此后，大肠杆菌O157:H7引起的感染在美国、加拿大、英国和日本等发达国家迅速增加,逐渐引起广泛重视。我国于1987年由权太叔等首次

4、从出血性结肠炎患者粪便中分离到O157:H7大肠杆菌。此后，福建、浙江、广东、河北、宁夏等十几个省陆续分离出该菌。为防止类似事件出现，1997年5月建立了全国O157:H7大肠杆菌检测网络。   　　大肠杆菌O157:H7对人的致病力较强，每克感染载体含菌10个以上即可能引起感染。因此，在流行病学调查中，特异、灵敏及快速检测O157:H7的方法显得尤为重要。随着分子生物学技术的迅速发展，使得快速、准确检测O157:H7成为可能，并为该领域的研究开拓了更广阔的前景。　　2 分子生物学检测方法　　2.1聚合酶链反应(PCR)技术 　　该技术是最常

5、用的检测大肠杆菌O157:H7致病基因的方法。目前已从单一PCR发展到多重PCR乃至实时荧光定量PCR（RQ-PCR）。Paton等［3］采用多重PCR方法扩增stx1、stx2、eae、ehxA和saa基因，发现所检测的ETEC(大肠杆菌O157:H7是其中一种)中，有几种或全部为致病基因。Fey等［4］对335份腹泻患者的粪便样品进行选择性细菌培养，再从中选择可疑菌落进行检测。用多重PCR的方法检测到14株ETEC，与联合应用传统的细菌分离培养和酶免疫法(enzymeimmunoassay，EIA)相比，分离的菌株数相同。从而证明，PCR

6、是一种与细菌常规分离培养和EIA联合应用、具有相同敏感性和特异性的方法。由于其速度快，可作为一种诊断由EHEC感染引起腹泻的替代方法。   近年来，随着RQ-PCR的发展，这种技术也被用于大肠杆菌O157:H7的检测。RQ-PCR是利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。常规PCR技术只能对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确定量，也无法对扩增反应进行实时检测。RQ-PCR通过对引物、探针或扩增产物进行荧光标记使对积累的扩增产物进行实时检

7、测成为可能。Ct值即PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数，模板DNA量越多，荧光达阈值的循环数越少，即Ct值越小。朱海等［5］使用RQ-PCR检测生果、蔬菜中大肠杆菌O157∶H7，说明荧光定量PCR检测方法比传统分离培养法灵敏度更高。Bellin等［6］在45min内用这种方法检测了32个EHEC菌株中的stx1和stx2基因，证明实时定量PCR是一种快速检测EHEC的方法。同时，该试验对重复结果为阴性的试验也较为迅速。   因此，这种方法在处理大量怀疑含大肠杆菌O157:H7样品时可使用，如在临床微生物

8、中粪便分析或食品安全性检验中的应用。   运用PCR方法检测与疾病相关的毒素基因还有助于对疾病发病机理的了解。有研究表明［6］，从ETEC感染患者体内分离的EHEC