大肠杆菌PCR检测方法.doc

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1、ICS11.220B41DB21辽宁省地方标准DB21/XXXXX—XXXX大肠杆菌PCR检测方法MethodofPCRforthedetectionofEscherichiacoli点击此处添加与国际标准一致性程度的标识XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施辽宁省质量技术监督局发布前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由辽宁省动物疫病预防控制中心提出。本标准由辽宁省畜牧兽医局归口。本标准起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研究院。本标准主要起草人：赵凤菊，关淼，关乃鹏，李清竹，陈瑶大肠杆菌PCR检测方法1　范围本标准规定了大肠杆菌PCR检测方

2、法的技术要求。本标准适用于大肠杆菌的诊断、监测及流行病学调查，适用于猪粪便、脏器及纯培养物中大肠杆菌的检测。本标准中的试验操作应在生物安全Ⅱ级（BSL-2）以上的实验室进行。2　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。中华人民共和国农业部公告第302号兽医实验室生物安全技术管理规范3　缩略语下列缩略语适用于本标准。E.coli：大肠杆菌（Escherichiacoli）DNA：脱氧核糖核酸（Diethylpyrocarbonate）bp：碱基对（basepair

3、）PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（Deoxy-ribonucleosidetriphosphate）Taq酶：ExTaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）TAE：三羟甲基氨基甲烷-乙酸电泳缓冲液（Trisacetate-EDTAbuffer）4　原理根据E.coli保守基因序列设计一对引物，在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以引物为延伸起点，通过变性、退火和延伸，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA。5　仪器和器材本技术规范中需应用下列仪器和器材：高速台式冷冻离心机（最大离心力12000g以上）

4、、冰箱、PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像系统、微波炉、分析天平、1.5mL离心管和0.2mL离心管、微量移液器和吸头等。6　试剂和材料6.1　DNAzol®Reagent：DNA抽提试剂，外观为淡绿色，于4～8℃保存。6.2　无水乙醇：-20℃预冷。6.3　75%乙醇：用无水乙醇和灭菌双蒸水配制，-20℃预冷。6.4　DNA聚合酶：ExTaqDNA聚合酶（5U/μL）。6.5　dNTP(2.5mmol/L)。1.1　引物：引物浓度为20μmol/L；上游引物序列为5’-GCCTCGCCTGGAGAATGA-3’，下游引物序列为5’-CCTGAGACTGCGGTGGAA-3’。1.2　阴性对照：

5、灭菌双蒸水1.3　阳性对照：E.coliATCC25922。1.4　无菌生理盐水。1.5　TAE：Tris-乙酸电泳缓冲液，1.6　溴化乙锭。1.7　DL2000DNAMarker。注：本技术规范中使用的试剂，除另有说明外，所用试剂均为分析纯；所有试剂均用无菌的容器分装。2　操作步骤2.1　样品的采集、前处理、存放与运输2.1.1　采样注意事项采样及样品前处理过程中应戴一次性手套，样本间不得交叉污染。2.1.2　采样工具药匙、15mL离心管和1.5mL离心管经121（士2）℃均高压灭菌20min；剪刀、镊子经160℃干热灭菌2h。2.1.3　内脏样品的采集与前处理采取病死或剖杀猪主要脏器（肝

6、脏、脾脏、肺脏）装入灭菌15mL离心管中，编号，送实验室。称取1g病料进行研磨，然后加入1mL无菌生理盐水，混匀，3000rpm离心20min，取上清液转入1.5mL离心管中编号备用。2.1.4　内容物的采集与前处理采取病死或剖杀猪的小肠内容物，装入15mL灭菌离心管中，按1：5倍体积加入无菌生理盐水，混匀，3000rpm离心20min，取上清液转入1.5mL离心管中编号备用。2.1.5　粪便的采集与前处理用药匙无菌采取发病猪新鲜粪便，装入15mL灭菌离心管中，按1：5倍体积加入无菌生理盐水，混匀，3000rpm离心20min，取上清液转入1.5mL离心管中编号备用。2.1.6　血液无菌采集

7、心血，按1：1倍体积加入无菌生理盐水，混匀，转入1.5mL灭菌离心管中编号备用。2.1.7　大肠杆菌纯培养物挑取37℃18～24h培养的典型菌落，用1mL无菌生理盐水制备成一定浓度的菌悬液。然后转入1.5mL灭菌离心管中编号备用，待检。2.1.8　保存与运输采集或处理的样品在2～8℃条件下保存应不超过24h；若需长期保存，应放置-70℃冰箱，但应避免反复冻融(冻融不超过3次)。采集的样品密封后，采用保温壶或保