圆二色光谱在研究蛋白结构中的应用

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1、圆二色光谱在蛋白质结构研究中的应用摘要：圆二色光谱（CD）是研究手性分子结构的重要工具，近年来圆二色光谱在蛋白结构分析中应用越来越广泛。本文综述了圆二色产生原理及与蛋白质结构关系并简单阐述了圆二色光谱在研究蛋白结构中的应用案例。关键词：圆二色光谱；蛋白质；构象；由于光学活性分子对左、右圆偏振光的吸收不同,使得左、右圆偏振光透过后变成椭圆偏振光,这种现象就是圆二色性(circularDichroism,简称CD)。历史上，圆二色性又称为光学活性，巴斯德在19世纪就发现并研究了柠檬酸的光学活性。传统的圆二色谱是指波长在200～400n

2、m之间的吸收谱,20世纪70年代,由于“八区律”、“激子手性法”[1]等方法的发现和发展,圆二色谱得到了广泛应用。圆二色光谱是一种差光谱,是样品在左右旋偏振光照射下的吸收光谱差值。由于生物大分子基本都含有手性的基团和结构，圆二色光谱可以帮助测量和观察生物大分子的结构和构象变化，也可应用于研究DNA/RNA反应、酶动力学、光学活性物质纯度测量、药物定量分析；天然有机化学与立体有机化学、物理化学、生物化学与宏观大分子、金属络合物、聚合物化学等相关的科学研究。蛋白质是由氨基酸通过肽键连接而成的具有特定结构的生物大分子,它并不是以长链分子

3、的状态存在，而是折叠成特定的三维结构。因此可以用圆二色技术测定蛋白质分子结构。目前，测定蛋白质分子构象的方法还有X-射线衍射，核磁共振技术及冷冻电子显微技术[2]等。在专门存储蛋白质和核酸分子结构的蛋白质数据库中，接近90%的蛋白质结构是用X射线晶体学的方法测定的。大约9%的已知蛋白结构是通过核磁共振技术来测定的。此外冷冻电子显微技术是近年来兴起的一种获得低分辨率（低于5埃）蛋白质结构的方法。但是X-射线衍射技术对于分析结构复杂、柔性的生物大分子蛋白质，适合的单晶培养限制了它的应用。二维、多维核磁共振技术适用于较小分子量蛋白质构相

4、分析且数据处理过程繁琐。冷冻电子显微技术只能用于形成二维晶体的体系，且需要专门的冷冻平台。相比而言，圆二色光谱是研究稀溶液中蛋白质构相的一种快速简便的方法。此外，圆二色对构象变化敏感，它可灵敏地检测一些反应引起的构象变化，特别适用于观测蛋白质的变性。利用圆二色性研究蛋白结构的工作始于1962年，Holzawarth与Doty发表了利用圆二色技术测定多聚氨基酸和肌红蛋白构象。1969年Greenfield应用圆二色光谱数据估计了蛋白质二级结构[3]，之后有关CD光谱研究蛋白质结构的报道增多。近几年来，圆二色技术得到了科学工作者越来越

5、多的关注。1.蛋白质的圆二色性原理蛋白质一般有一级结构、二级结构、三级结构、四级结构几个主要结构层次,有的还有结构域或超二级结构。在蛋白质和多肽分子中,肽链骨架中的肽键、芳香氨基酸残基及二硫桥键是主要的光活性生色基团,当平面圆偏振光通过时,这些生色基团对左右圆偏振光的吸收不同,造成偏振光矢量的振幅差,使得圆偏振光变成了椭圆偏振光,就产生了蛋白质的圆二色性[4]。另外，有的蛋白质辅基对蛋白质的圆二色性也有影响。蛋白质的圆二色性主要由活性生色基团及折叠结构两方面圆二色性的总和。根据电子跃迁能级能量的大小，蛋白质的CD光谱分为三个波长范

6、围[5](1)250nm以下的远紫外光谱区，圆二色性主要由肽键的n-π*电子跃迁引起(酰胺键的吸收在190nm-250nm)，这一波长范围的CD谱包含蛋白质主链构象的信息。(2)250～300nm的近紫外光谱区[6]，主要由侧链芳香基团的π-π*电子跃迁引起,这一区域可给出“局域”侧链间的相互作用。(3)300-700nm的紫外可见光光谱区，主要由蛋白质辅基等外在生色基团引起。这一波段的CD谱对金属离子的氧化态、配位态及链与链间的相互作用敏感。远紫外区的圆二色光谱反映了蛋白质或多肽的规则二级结构中肽键排列的方向和能级跃迁情况,通过

7、对谱带位置和吸收强弱的分析对比,就能研究不同蛋白质或多肽的二级结构;近紫外区的圆二色光谱反映了芳香族氨基酸残基和二硫键在不对称环境中的圆二色性,主要揭示蛋白质的三级结构信息，研究不对称微环境的变化和影响,对肽键在远紫外区的CD信号并不造成干扰,在研究中可以将这些信息作为光谱探针。紫外-可见光谱主要用于辅基的偶合分析[7]。2.圆二色光谱研究蛋白质的二级结构与构象变化远紫外区CD光谱主要反映肽键的圆二色性。在蛋白质或多肽的规则二级结构中，肽键是高度有规律排列的，其排列的方向性决定了肽键能级跃迁的分裂情况。具有不同二级结构的蛋白质或多

8、肽所产生CD谱带的位置、吸收的强弱都不相同。α一螺旋结构在靠近192nm有一正的谱带，在222nm和208nm处表现出两个负的特征肩峰谱带；β-折叠的CD光谱在216nm有一负谱带，在185-200nm有一正谱带；β-转角则在206nm附近有一正C