圆二色光谱法研究环境因素对细胞红蛋白二级结构的影响

《圆二色光谱法研究环境因素对细胞红蛋白二级结构的影响》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、圆二色光谱法研究环境因素对细胞红蛋白二级结构的影响作者：田素燕李连之高磊穆建帅刘晓燕谭相石【摘要】采用远紫外圆二色光谱法系统地研究了细胞红蛋白(cytoglobin,Cygb)的浓度、环境温度、溶液的pH值和溶剂性质对细胞红蛋白二级结构的影响。结果表明:当Cygb浓度<1μmol/L时，它主要以α螺旋形式存在，其α螺旋含量>60%;当Cygb浓度从0.3μmol/L增大到2.0μmol/L时，其α螺旋含量迅速降低;当Cygb浓度>2.0μmol/L时，其α螺旋含量随浓度的增大变化很小(约30%)。随着温度的升高，Cygb的α螺旋含量逐

2、渐减小，但既使温度达到368K，它仍保持有20%的α螺旋结构，说明该蛋白具有较高的热稳定性。在弱酸性和弱碱性溶液中，Cygb的二级结构都会有不同程度的破坏。在甲醇和乙醇中，Cygb的α螺旋含量明显增加，这说明醇类可以诱导其α螺旋的生成。【关键词】细胞红蛋白,圆二色光谱,二级结构,α螺旋　1引言　　细胞红蛋白(cytoglobin,Cygb)是近期在脊椎动物组织中发现的第4种珠蛋白[1]，它具有典型珠蛋白的“threeoverthree”11类型的α螺旋三明治折叠结构，但E螺旋中的His81却与血红素配位，形成与神经红蛋白(neuroglobin,

3、Ngb)相似的六配位的血红素[2,3]。Cygb在人体各类组织中几乎都有表达，但其确切的生物功能目前还不完全清楚。研究表明，Cygb可能具有携氧、储氧、氧感受器以及过氧化物酶等功能，此外它也可能与胶原形成有关[4]。　　目前，在Cygb的空间结构、携氧动力学特征和功能多样性等方面都有了一定的研究[1,4～7]，但对Cygb在溶液中的结构特性以及各种环境因素对其结构和构象的影响的研究甚少。研究蛋白质在溶液中的结构状态及结构变化对于了解其功能至关重要，圆二色光谱(CD)是研究溶液中蛋白质二级结构的一种强有力的实验方法[8～10]。本研究以远紫外圆二色光谱技术研究了细

4、胞红蛋白的浓度、环境温度、溶液的pH值和溶剂性质对Cygb二级结构的影响，深入了解Cygb化学生物学的基本性质，为研究Cygb的生物功能及其在医药学的的应用提供有用的信息。2实验部分　　2.1仪器与试剂　　AKTApurifier100快速蛋白纯化系统(瑞典AmershamBiosciences公司);J810圆二色光谱仪(日本Jasco公司);HP845311型紫外可见阵列二极管分光光度计(美国HewlettPackard公司)，pHS3DpH计(上海雷磁公司)。　　带有人细胞红蛋白基因的pET3a质粒由德国JohannesGutenbergUniver

5、sityofMainz大学FrankGerlach教授提供。E.ColiBL21(DE3)plys为本实验室保存，酵母提取物和胰化蛋白胨(英国Oxoid公司)，实验用水为二次去离子水，其它试剂均为国产分析纯或生化试剂。　　2.2细胞红蛋白样品的制备　　将带有细胞红蛋白基因的pET3a质粒转入E.ColiBL21(DE3)plys细菌中，按文献[11]方法进行发酵表达，收集菌体。此蛋白以可溶性和包涵体两种形式表达，本研究以更接近天然态的可溶性形式表达的蛋白为研究对象。可溶性形式表达的蛋白依次经(NH4)2SO4分级沉淀，QSepharoseFF阴离子交换柱，Hil

6、oad16/60Superdex75凝胶过滤柱和CMSepharoseFF阳离子交换柱纯化，得到电泳纯的细胞红蛋白。细胞红蛋白贮存液的浓度通过测定其在280nm处的吸光度值(ε280=27.8L/(mmol·cm))计算[12]得到。　　2.3圆二色光谱的测定11　　在5mmol/LTrisHCl(pH7.4)缓冲溶液中，蛋白终浓度依次为0.3,0.9,1.5,2.0,3.1,3.9,4.8,5.3,9.6和19.4μmol/L时考察蛋白浓度对Cygb的CD谱的影响。在10mmol/LTrisHCl(pH7.4)缓冲溶液中，蛋白终浓度为1.5μmol/L，每

7、个测量温度(298.0～368.0K)温育10min，考察温度对Cygb的CD谱的影响。在10mmol/LTris碱贮存液中，加HCl或NaOH溶液调节其pH值至所需范围(2.2～12.0)，用pHS3DpH计测量pH值，蛋白终浓度为4.5μmol/L，4℃放置12h，考察不同pH溶液对Cygb的CD谱的影响。溶剂分别为水、100%甲醇、70%乙醇，蛋白终浓度为4.8μmol/L，4℃放置12h，考察溶剂性质对Cygb的CD谱的影响。　　在JascoJ810圆二色光谱仪上进行圆二色光谱测量，并配备恒温样品池支架和JulaboF12恒温器，光源系统用氮气保护(

8、流量为5L/min)，除